تكوين المشبك المناعي بين الخلايا التائية المساعدة والخلايا العارضة للمستضد

الملخص

المصدر: Bello-Gamboa ، A. et al. ، تصوير المشبك المناعي البشري.J. Vis. Exp.(2019)

يوضح هذا الفيديو الدراسة المختبرية لتكوين المشبك المناعي بين الخلية العارضة للمستضد والخلايا الليمفاوية التائية المساعدة باستخدام المجهر الفلوري. تتفاعل مستقبلات الخلايا التائية للخلايا الليمفاوية التائية المساعدة مع مركب مستضد-معقد التوافق النسيجي الكبير الثاني في الخلايا العارضة للمستضد وتشكل نقاط الاشتباك المناعي ، تليها حركات الحويصلة الإفرازية نحو المشبك ، والتي يتم تصورها بواسطة المجهر الفلوري.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الشرائح للالتصاق بخلايا الراجي

1. أضف 150 ميكرولتر من الفبرونيكتين (100 ميكروغرام / مل) لكل بئر إلى شريحة غرفة 8 ميكرو آبار (شريحة غرفة بلاستيكية ذات قاع بلاستيكي) واحتضانها لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. ستسمح ركيزة الالتصاق هذه بربط خلايا راجي بقاع البئر (الخطوة 2) ، وتكوين مترافقات حية مع خلايا جوركات (الخطوة 4) ، والتقاط المجهر بفاصل زمني (الخطوة 6) ، كما أنها متوافقة بعد ذلك مع تثبيت بارافورمالدهايد الاختياري (PFA). < / > ملاحظة: لتثبيت الأسيتون ، استخدم شرائح الحجرة السفلية الزجاجية وبولي إل ليسين (20 ميكروغرام / مل) بدلا من الفيبرونكتين ، لأن الأسيتون يذيب البلاستيك. شريحة الغرفة 8 ميكروويل (1 سم² بئر ، 300 ميكرولتر كحد أقصى) أو ما يعادلها هي تنسيق مرن ومناسب.
2. قم بشفط الفيبرونيكتين باستخدام ماصة أوتوماتيكية سعة 200 ميكرولتر واغسل كل بئر ب 200 ميكرولتر من PBS لمدة دقيقتين مع رج لطيف. كرر هذا الغسيل مرة أخرى. يمكن تخزين شريحة الغرفة في هذه المرحلة باستخدام PBS لمدة 1-2 أسابيع عند 4 درجات مئوية.

< p class = "jove_title" >2. التصاق خلايا راجي بشرائح الغرفة ووضع العلامات 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC)

1. نقل 10 مل من مزرعة مسبقة (1-2 × 10⁶ خلايا / مل) لخلايا الراجي إلى أنبوب 15 مل ، قاع V. تخلط جيدا وتستخدم 10 ميكرولتر لحساب الخلايا الموجودة في غرفة Neubauer أو ما يعادلها.
2. الطرد المركزي للخلايا المتبقية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشق وتخلص من المادة الطافية.
3. أعد تعليق حبيبات الخلية برفق في وسط ثقافة دافئ كامل (RPMI 1640 مكمل ب 10٪ FCS ، 2 ملي جلوتامين ، 10 ملي مولار HEPES ، 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين) بتركيز 10⁶ خلايا / مل. استخدم المعادلة الواردة أدناه:
   ([] _{الأولي ×} الخامس_الأولي = [] _{النهائي} × الخامس_{النهائي}) ، حيث يمثل [] _الأولي تركيز الخلية الأولي ، V_الأولي = الحجم الأولي لتعليق الخلية ، [] _{النهائي} = التركيز النهائي للخلية ، V_{النهائي} = الحجم النهائي لتعليق الخلية.
   ملاحظة: اعتمادا على تركيز الخلية في مزرعة البداية ، من الممكن جمع خلايا أكثر من اللازم ولكن من المهم الحفاظ على الخلايا المتبقية في الثقافة (37 درجة مئوية) حتى نهاية التجربة من أجل منع المشاكل المحتملة (انظر الخطوة 2.6).
4. قم بتسمية خلايا راجي للسماح بالتعرف عليها أثناء تكوين المترافق المشبكي. في هذه التجربة ، يتم إجراء وضع العلامات على 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) في الخطوة 2.4.2.
   1. انقل العدد المطلوب من خلايا الراجي في وسط الاستزراع إلى أنبوب سعة 2 مل. بالنسبة لشرائح غرفة 8 ميكروويل ، هناك حاجة إلى ما مجموعه 1.6 مل من تعليق الخلية (200 ميكرولتر لكل بئر).
   2. أضف CMAC إلى التركيز النهائي البالغ 10 ميكرومتر. حافظ على الخلايا في الظلام عن طريق تغطية الأنبوب بورق الألمنيوم لأن CMAC حساس للضوء. هناك حاجة إلى 200 ميكرولتر تحتوي على 2 × 10⁵ خلايا راجي لكل 1 سم² بئر. وبالتالي ، إذا كانت هناك حاجة إلى تحضير 8 آبار ، فستكون هناك حاجة إلى 1.6 × 10⁶ خلايا راجي. < / > ملاحظة: إن وضع العلامات على خلايا الراجي باللون الأزرق لتتبع الخلايا (CMAC ، وإثارة الأشعة فوق البنفسجية ، والانبعاث الأزرق) يميزها عن الخلايا Th عند تكوين المترافقات المتشابكة. هذه الصبغة متوافقة مع مثبتات PFA والأسيتون وتسمح بمزيد من إجراءات التألق المناعي. حاول تجنب عرض الضوء. يضمن وضع العلامات على خلايا راجي في بركة مع CMAC متبوعا بإعادة التعليق قبل التصاق خلايا راجي بشرائح الغرفة المغلفة بالفبرونكتين وضع العلامات المتجانسة لخلايا راجي مع CMAC بين الآبار المختلفة.
5. قم بإعادة تعليق الخلايا الملطخة ب CMAC ، وبعد شفط PBS في شريحة الغرفة من الخطوة 1.2 ، قم بنقل 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من شرائح الغرفة المطلية بالفبرونكتين المعدة في الخطوات 1.1-1.2. احتضان شريحة الغرفة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 30 دقيقة - 1 ساعة><. ملاحظة: سيحدث الالتصاق ووضع العلامات CMAC في وقت واحد في هذه الخطوة وهذا يوفر الوقت. يرجى العلم أن خلايا الراجي سوف تترسب بسرعة ويجب توخي الحذر للحفاظ على تركيز متجانس في معلق الخلية قبل البذر. ليس من الضروري غسل CMAC في هذه المرحلة عن طريق الطرد المركزي لأن غسل CMAC سيتم القيام به بسهولة أكبر في الخطوة 2.7 (عندما تلتصق خلايا راجي المسماة بالفعل بشرائح الغرفة). نظرا لوجود CMAC في تعليق الخلية بشكل زائد ، فإن الخلفية الفلورية الزرقاء مرتفعة جدا بحيث لا يمكن تمييز الخلايا الملطخة باللون الأزرق. تحقق من تألق الخلية CMAC في الخطوة 2.7 بعد غسل CMAC.
6. تأكد من أن خلايا الراجي ملتصقة بقاع الآبار عن طريق الرج اللطيف لشرائح الغرفة على المجهر. تأكد من أن الخلايا تعرض فجوات بين بعضها البعض وليست متقاربة (الشكل 1 ، اللوحة الوسطى). 50-60٪ من التقاء الخلايا مناسب.
   1. إذا التزمت معظم الخلايا بكفاءة بشريحة الغرفة ولم يتم ملاحظة أي فجوات في الخلية، اغسل كل بئر بوسط كامل دافئ وأعد تعليق الوسط باستخدام ماصة أوتوماتيكية سعة 200 ميكرولتر لفصل فائض الخلية. تحقق من التقاء بعد كل خطوة إعادة تعليق.
   2. إذا لم تلتصق الخلايا ، كرر خطوة الالتصاق مرة أخرى وقم بزيادة وقت الالتصاق و / أو رقم الخلية.
      ملاحظة: من الممكن التوقف هنا ، واحتضان شريحة الغرفة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ بين عشية وضحاها (O / N) ، والاستمرار في البروتوكول في اليوم التالي. يرجى التأكيد في اليوم التالي على أن خلايا راجي تظل ملتصقة ومصنفة CMAC باستخدام الفحص المجهري الفلوري.
7. اغسل كل بئر مرة أخرى بعناية باستخدام RPMI المكمل الدافئ للتخلص من CMAC الزائد والتحقق من الانبعاث الأزرق باستخدام المجهر الفلوري (الشكل 1).
   ملاحظة: لتجنب استخدام زيت الغاطس (اللزج واللزج) وأهداف زيت الفتحة العددية العالية ، يمكن استخدام أهداف المسافات الطويلة جدا (أي 20x أو 40x) للتحقق بسرعة من وضع العلامات CMAC باستخدام المجهر الفلوري.

3. نبض CMAC - خلايا راجي المسمى بالسموم المعوية بالمكورات العنقودية E

1. أضف السموم المعوية بالمكورات العنقودية E (انظر ، 1 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر. يمكن تخفيف SEE بشكل ملائم في وسط زراعة الخلايا (محلول العمل عند 100 ميكروغرام / مل) من مخزونات SEE المجمدة (1 مجم / مل في PBS). استخدم 2 ميكرولتر من محلول العمل 100x لكل 200 ميكرو لتر ميكروويل. < / > تنبيه: استخدم القفازات لهذه الخطوة وتخلص من الطرف المستخدم في صندوق الخطر البيولوجي.
2. احتضان شريحة الغرفة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 30 دقيقة على الأقل. يستمر تأثير SEE لمدة 3-4 ساعات على الأقل.
   ملاحظة: يمكن إضافة SEE إلى الآبار في نقاط زمنية مختلفة عند الحاجة إذا تم التخطيط لإعدادات اللقطات المتتابعة المميزة (الخطوة 5) و / أو اعتمادا على نقطة وقت البدء لتجارب نقطة النهاية (الخطوة 6).

< p class = "jove_title" >4. تحضير خلايا Jurkat

1. استخدم مزرعة تنمو سابقا لخلايا Jurkat (1-2 × 10⁶ خلايا / مل) لهذه التجربة. استخدم الخلايا من قارورة مزرعة قياسية أو من تعداء سابقة باتباع بروتوكولات التثقيب الكهربائي القياسية ، كما هو موضح سابقا. سيسمح تعداء خلايا Jurkat بالتصور بفاصل زمني لحركة الحبيبات الإفرازية في الخلايا الحية. على سبيل المثال ، عندما يتم التعبير عن GFP-CD63 (علامة MVB) ، يمكن تسجيل حركة الحويصلات المزخرفة ب GFP-CD63.
2. راقب الخلايا تحت مجهر تباين الطور. إذا لوحظ وجود فائض من الخلايا الميتة (>20-30٪) ، فقم بإجراء الطرد المركزي لتدرج الكثافة Ficoll باستخدام البروتوكولات القياسية ، للتخلص من فائض الخلايا الميتة (تظهر الخلايا الميتة كثافة أعلى من الخلايا الحية) قبل الاستخدام (انظر المناقشة).
3. انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مل ، أنبوب V-bottom ، واستخدم 10 ميكرولتر للعد باستخدام مقياس كثافة الدم.
4. الطرد المركزي للخلايا المتبقية كما هو موضح في الخطوة 2.2. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا بنفس تركيز خلايا الراجي (1 × 10⁶ / مل) باستخدام وسط ثقافة طازج ودافئ. اتبع الخطوات 2.2-2.3.
5. حافظ على خلايا Jurkat في الثقافة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) أثناء انتظار الخطوة 4.
   ملاحظة: في الخيار الثاني (التعداد) ، سيكون عدد الخلايا الحية أقل بكثير مما كان عليه في الخيار الأول. وبالتالي ، ضع في اعتبارك استخدام حجم ثقافة خلية بدء أعلى من أجل الحصول على خلايا كافية للتجربة. من 10 × 10⁶ خلايا Jurkat لكل كوفيت كهربائي وتعداء ، ستبقى خلايا Jurkat فقط 2-4 × 10⁶ خلايا Jurkat على قيد الحياة بعد 48 ساعة من التعدي وستفقد بعض هذه الخلايا أثناء خطوة Ficoll. وبالتالي ، فإن كوفيت واحد للتثقيب الكهربائي يكفي بشكل عام لتحدي خلايا الراجي النبضية الملتصقة من 8 ميكروويل (1.6 × 10⁶ خلايا Jurkat المنقولة المطلوبة).

< p class = "jove_title" >5. البذر المشترك لخلايا راجي وجوركات

1. خذ شرائح الغرفة التي تحتوي على خلايا الراجي الملتصقة ب CMAC ، والتي تم نبضها ، من الحاضنة من الخطوة 3.2. ليس من الضروري غسل CMAC في هذه المرحلة حيث تم ذلك سابقا في الخطوة 2.7.
2. استنشق بعناية وسط استزراع كل بئر، واحدا تلو الآخر، من أحد أركان البئر باستخدام ماصة أوتوماتيكية سعة 200 ميكرولتر. لا تدع الوسط الموجود في البئر يجف تماما.
3. استبدل الوسط على الفور ب 200 ميكرولتر من خلايا جوركات المعلقة في وسط زراعة الخلايا (1 × 10⁶ / مل) المحضر في الخطوة 4.5. إذا تم إجراء التصوير بفاصل زمني ، فانتقل إلى الخطوة 6 مباشرة بعد هذه الخطوة ، لأن خلايا Jurkat تميل إلى الترسيب وتشكيل مترافقات متشابكة بسرعة كبيرة. للراحة ، يجب الحفاظ على الآبار الصغيرة التي تحتوي على خلايا راجي النبضية والملتصقة ب SEE والتي لا تتلقى البذر بخلايا جوركات في هذه المرحلة بوسط زراعة الخلايا حتى التحدي اللاحق مع خلايا جوركات. سيسمح هذا بمرونة بالتحديات اللاحقة مع خلايا Jurkat للحصول على مناهج تجريبية إضافية بفاصل زمني أو عكسي
وحركية نقطية نهاية.
4. إذا كان سيتم إجراء فاصل زمني ، فانتقل بسرعة إلى الخطوة 6. يتضمن ذلك الزراعة المشتركة لمدة 1-2 ساعة على حاضنة مرحلة المجهر أو ما يعادلها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ للسماح بالتكوين المترافق المشبكي والحصول على الصورة المتزامنة. إذا كان من المتوقع تحليل نقطة النهاية ، ولكن بدون فاصل زمني ، تحقق من التكوين المترافق بعد فترة الزراعة المشتركة باستخدام المجهر (كما في الشكل 1) قبل تثبيت الخلايا.

< p class = "jove_title" >6. تصوير الفاصل الزمني للمترافقات المشبكية الناشئة

1. تحضير المجهر وغرفة الحضانة قبل التصوير. على سبيل المثال ، يتم عرض إعدادات الفحص المجهري التفصيلية في الشكل 2.
   ملاحظة: إذا تم التخطيط لتجربة الفاصل الزمني ، فيجب إعداد جميع إعدادات المجهر والمكملات (غرفة زراعة الخلايا المحيطة ، وما إلى ذلك) قبل إضافة تعليق Jurkat إلى شريحة الغرفة مع خلايا راجي الملتصقة. يتم وصف الخطوات التالية للمجهر التجاري (جدول المواد). ومع ذلك ، يمكن استخدام أي مجهر مضان مقلوب مزود بحاضنة لزراعة الخلايا.
   1. استخدم مجهرا مع غمر الزيت بمعدل 60 ضعفا ، وفتحة عدلية عالية عند تصوير حركة المرور المستقطبة.
   2. تأكد من تشغيل نظام التركيز البؤري التلقائي واضبط الإزاحة لتركيز خلايا الراجي المرتبطة بالسطح السفلي. يرجى الرجوع إلى الشكل 1.
2. بعد إضافة Jurkat إلى كل بئر يحتوي على خلايا الراجي الملتصقة في الخطوة 5.3 ، حدد موقع شريحة غرفة microwell بسرعة على حاضنة مرحلة المجهر المسخنة مسبقا (1-2 ساعة) (أي OKOlab) وحدد بعض مواضع XY باستخدام المجهر ، وهي الحقول التي من المحتمل أن تسجل فيها تكوين IS ناشئ تم إنشاؤه بواسطة ، على سبيل المثال ، خلية منقولة Jurkat تقع في بؤرة المجهر.
3. استخدم حاضنة مرحلة المجهر المسخن مسبقا حيث لوحظ أن المرحلة المستقرة في درجة الحرارة تحافظ على مواضع X و Y و Z مستقرة. معايير مجال XY الملائم هي: خلايا راجي جيدة التركيز وغير ملتصقة (أي عرض الفجوات بين الخلايا) ووجود خلايا Jurkat المنقولة (يمكن التحقق من ذلك عن طريق الجمع بين النفاذية وقنوات الأشعة فوق البنفسجية أو GFP). سوف تترسب خلايا Jurkat بسرعة كبيرة (بضع دقائق) على شريحة الغرفة ، وستتقل فرص تصوير نقاط الاشتباك العصبي الناشئة بمرور الوقت (الشكل 1). من الممكن إما إنهاء التجربة بعد الفاصل الزمني المحدد أو المتابعة إلى الخطوة 7 وإصلاح المترافنات للتألق المناعي والتحليلات اللاحقة.
   ملاحظة: من الممكن تحديد ما يصل إلى 16 مجالا مجهريا مختلفا من ما يصل إلى 4 آبار صغيرة مختلفة للحصول على فاصل زمني متزامن متعدد الآبار مع الدقة الزمنية المناسبة (1-2 دقيقة لكل إطار). يعتمد القيد على كل من عدد وشدة (التأثير على عرض الكاميرا) للفلوروكرومات المتنوعة المراد تصويرها (اعتمادا على عدد البروتينات الفلورية المعبر عنها ، بصرف النظر عن CMAC). تتمثل إحدى طرق زيادة معدل الإطارات في التسجيل لقناة CMAC في إطار واحد فقط من كل إطار زمني "n" ل GFP (أي n = 8 ، كما هو موضح في الشكل 2) نظرا لأن خلايا Raji ملتصقة بقاع البئر ولا تتحرك بسهولة كخلايا Jurkat. بالإضافة إلى ذلك ، يفيد هذا صلاحية الخلية ، لأن التعرض المتكرر للأشعة فوق البنفسجية قد يؤدي إلى إتلاف الخلايا. حاول ضبط معدل الإطار الزمني إلى إطار واحد كل دقيقة واحدة أو أقل (أي 20 ثانية لكل إطار ، الشكل 2) لأن استقطاب MVB يستغرق بضع دقائق إلى ساعات حتى يكتمل. من الضروري وجود مجهر مجهز ببرج مضان epi-fluoring آلي ومرشحات مضان مناسبة لتمرير النطاق أو ما يعادلها لإجراء هذا الالتقاط متعدد القنوات.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
يمثل الشكل 1 اقترانات Jurkat-Raji المشبكية التي تم الحصول عليها باتباع البروتوكول (الخطوة 5.2). تمثل الصورة الإطار الأول من تجربة تمثيلية بفاصل زمني. تمت إضافة 2 × 10⁵ خلايا راجي و 2 × 10⁵ خلايا جوركات إلى بئر 1 سم². تظهر اللوحة العلوية قناة النفاذية ، وتتكون اللوحة الوسطى من قناة CMAC (زرقاء) (خلايا راجي) ، وتعرض اللوحة السفلية كلا من النفاذية بالإضافة إلى...

المواد