التعرف على علامة القرص المضغوط للخلايا القاتلة التي يسببها السيتوكينات البشرية عن طريق قياس التدفق الخلوي

الملخص

المصدر: Hsiao ، C. H. ، et al. عزل وتوسيع الخلايا التائية القاتلة التي يسببها السيتوكينات السامة للخلايا لعلاج السرطان. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية قائمة على قياس التدفق الخلوي لتحديد نسبة الخلايا التائية القاتلة التي يسببها السيتوكين ، خلايا CIK ، التي توسعت من ثقافة الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. تحريض CIK وتوسيعها

1. في اليوم 0 ، استزراع PBMCs (1 × 10⁶) في وسط قاعدي طازج يحتوي على 1,000 وحدة دولية / مل من IFN-γ لمدة 24 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. في اليوم 1 ، قم بتحديث الوسط بوسط قاعدي طازج يحتوي على 50 نانوغرام / مل من الجسم المضاد ل CD3 ، و 1 نانوغرام / مل من rh IL-1α ، و 1,000 وحدة / مل من rh IL-2. قم بتحديث الوسط كل 3 أيام.
3. في اليوم 7 ، قم بتحديث الوسط بوسط قاعدي طازج يحتوي على 1,000 وحدة / مل من rh IL-2. قم بتحديث الوسط كل 3 أيام حتى نهاية تمدد الخلية (اليوم 14).

< p class = "jove_title" >2. التنميط المناعي لتقييم خلايا CIK

1. اغسل خلايا CIK ب 10 مل من PBS المعقم. جهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 300 × جم و 18-20 درجة مئوية ، قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا ب 10 مل من PBS. احسب رقم الخلية واختبار صلاحية الخلية باستخدام مقايسة استبعاد trypan blue.
2. قم بتقسيم خلايا CIK إلى ستة أنابيب معقمة سعة 1.5 مل بكثافة ~ 5-10 × 10⁵ خلايا / مل PBS. تسمية وعلاج على النحو التالي: الأنبوب 1 ، فارغ (بدون جسم مضاد) ؛ الأنبوب 2 ، أضف 20 ميكرولتر من النمط المتماثل IgG1-FITC ؛ الأنبوب 3 ، أضف 20 ميكرولتر من النمط المتماثل IgG1-APC mAbs ؛ الأنبوب 4 ، أضف 20 ميكرولتر من CD3-FITC ؛ الأنبوب 5 ، أضف 20 ميكرولتر من CD56-APC mAbs ؛ والأنبوب 6 ، أضف 20 ميكرولتر من CD3-FITC و 20 ميكرولتر من CD56-APC mAbs.
3. امزج خلايا CIK برفق مع الأجسام المضادة عن طريق ماصتها برفق لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل باستخدام ماصة معقمة سعة 1 مل ، ثم احتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
قم
4. بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 10 دقائق عند 300 × جم و 18-20 درجة مئوية. قم بتثبيتها برفق لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل باستخدام ماصة معقمة سعة 1 مل.
5. كرر الخطوة 2.4.
6. اترك الأنابيب في الظلام قبل تحليل التدفق الخلوي.

3. التعرف على علامة القرص المضغوط

1. انقل معلق الخلية إلى أنبوب معقم من البوليسترين مستدير بسعة 5 مل مع غطاء مصفاة خلية (شبكة 100 ميكرومتر) عن طريق سحب العينة برفق عبر الغطاء. ضع الأنابيب على الرف الدائري بالترتيب.
2. افتح برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي وأنشئ مجلدا تجريبيا. انقر فوق الزر عينة جديدة لإضافة عينة وأنبوب إلى التجربة وتسمية الأنابيب على النحو التالي: الأنبوب 1 ، فارغ ؛ أنبوب 2 ، النمط المتماثل IgG1-CD3 ؛ أنبوب 3 ، النمط المتماثل IgG1-CD56 ؛ أنبوب 4 ، CD3 ؛ أنبوب 5 ، CD56 ؛ الأنبوب 6 ، CD3CD56.
3. قم بإنشاء نظام بوابات مبعثرة لمجموعات خلايا CIK (الشكل 1 أ).
   1. حدد الأنبوب 1 (فارغ) وانقر فوق الزر Dot Plot لإنشاء مخطط FSC-A / SSC-A. ارسم بوابة مستطيلة فوق مجموعة الخلايا بأكملها بعتبة FSC-A >5 × 10⁴ لاستبعاد بقايا الخلية.
   2. حدد المعلمة SSC-A/SSC-H للمخطط النقطي الجديد وارسم بوابة مضلع حول جميع الخلايا المفردة. حدد معلمات Count / FITC (CD3) و Count / APC (CD56) لمخطط الرسم البياني الجديد ، على التوالي. حدد المعلمة FITC (CD3) / APC (CD56) للمخطط النقطي الجديد وارسم بوابة من أربعة أرباع لتحديد المجموعات الفرعية الأربعة.
   3. سجل البيانات من 20,000 خلية مفردة في كل عينة. انقر فوق تحميل العينة زر لتحليل نموذج عنصر التحكم فارغ أولا. حدد مجموعة خلايا CIK بأكملها باستخدام معلمات قناة CD56 و CD3.
4. كرر الخطوة 3.3 للتحقيق في جميع العينات.
5. افتح الملفات التي تحتوي على القيم الإحصائية للعينة الفردية لتحليل مجموعات خلايا CIK وإعادة طباعتها في ملفات التحليل.

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1: نسبة الخلايا التائية CD3 ⁺ CD56 ⁺ من عينة PBMC التمثيلية.(أ) تم التعرف على الخلايا الليمفاوية من خلال الحجم المحدد والحبيبات. مجموعة خلية واحدة مختارة للتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي. (ب) أجري التحليل الإحصائي لفعالية توسع CIK من ثلاثة متبرعين أصحاء باستخدام اختبار t (*، ص < 0.01).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات APC Mouse المضاد للإنسان CD56 الأجسام المضادة دينار بحريني 555518 ب 159 APC ماوس IgG1 ، κ التحكم في النمط المتماثل دينار بحريني 555751 MOPC-21 BD FACSمقياس التدفق الخلوي الثاني دينار بحريني 338962 SN: R33896202856 Dulbecco's Modified Eagle Medium / F12 HyClone SH30023.02 الوسط القاعدي لزراعة خلايا OC-3 مصل الأبقار الجنينية HyClone SH30084.03 لزراعة الخلايا K562 و OC-3. الوسيط الكامل يحتوي على 10٪ من FBS فيكول باك بلس جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة 71101700-EK حل تدرج الكثافة FITC Mouse الأجسام المضادة CD3 المضادة للإنسان دينار بحريني 555332 UCHT1 ماوس FITC IgG1 ، κ التحكم في النمط المتماثل دينار بحريني 555748 MOPC-21 الإنسان المضاد ل CD3 mAb تاكارا تي 210 OKT3
أضف 2.5 مل من المرق (1 مجم / 1 مل) إلى 50 مل من وسط الحث. مخزون التخزين عند -80 درجة مئوية RPMI1640 متوسط جيبكو 11875-085 الوسط القاعدي لزراعة الخلايا K562. مخزون التخزين عند 4 درجات مئوية