اختبار لتحديد إفراز الإنترفيرون جاما في الأعضاء اللمفاوية الفئرانية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Mazet ، J. M. ، et al. تصوير إنتاج جاما الإنترفيرون في الموقع في طحال الفأر بعد عدوى الليستيريا الموحيدة. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو طريقة تصوير لتصور إفراز إنترفيرون جاما (IFN-γ) في طحال الفأر. بعد العدوى البكتيرية وتحريض تراكم IFN-γ داخل الخلايا التائية والخلايا القاتلة الطبيعية ، يتم حصاد الطحال من الفأر. عند الحصول على أقسام الأنسجة ، يتم إجراء التلوين المناعي لتصور IFN-γ داخل الخلايا.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. النقل بالتبني لخلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد في الفئران

1. عزل خلايا CD8 ⁺ T الخاصة بالبويض (OVA) التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (OTI-GFP) أو البروتين الفلوري الأحمر (OTI-RFP) من تعليق العقدة الليمفاوية للفئران المعدلة وراثيا لمستقبلات الخلايا التائية باستخدام مجموعة عزل الخلايا التائية CD8 ⁺ وفقا لتعليمات التصنيع. قم بإعداد تعليق الخلية عن طريق تحطيم الغدد الليمفاوية باستخدام مكبس حقنة ، كما هو موضح سابقا.
2. نقل خلايا OTI-GFP أو OTI-RFP (3 × 10⁶ خلايا) إلى متلقي الفئران من النوع البري C57BL / 6 عن طريق الحقن الوريدي كما هو موضح من قبل Cahalan ، وآخرون. استخدم الفئران التي يبلغ عمرها عادة من 6 إلى 12 أسبوعا.
   ملاحظه: هذه الخطوة اختيارية ومطلوبة فقط لتتبع خلايا CD8 ⁺ T الخاصة بالمستضد.

< p class = "jove_title" >2. عدوى الليستيريا monocytogenes

1. قم بتوسيع L. monocytogenes المعدلة وراثيا للتعبير عن OVA (LM-OVA) إلى مرحلة أسية من النمو في تسريب قلب المرق عند 37 درجة مئوية تحت التحريك اللطيف حتى يصل OD600 إلى 0.08-0.1 ، كما هو موضح سابقا.
2. حقن 100 ميكرولتر (الحجم الأقصى = 200 ميكرولتر) من 0.1-0.5 LD50 LM-OVA المخفف في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق الحقن الوريدي باستخدام حقنة أنسولين 29 جم ، في متلقي الفئران من النوع البري C57BL / 6 التي تحمل خلايا OTI-GFP أو OTI-RFP عند الحاجة.
   ملاحظه: في أيدينا ، 0.1 × LD50 LM-OVA يتوافق مع 2 × 10⁴ وحدات تشكيل مستعمرة (CFU). L. monocytogenes المعدلة وراثيا للتعبير عن OVA يستخدم لتنشيط الخلايا التائية OTI CD8 ⁺ T المنقولة مسبقا ، ولكن يمكن استخدام سلالات أخرى من L. monocytogenes.

< p class = "jove_title" >3. العلاج ب Brefeldin A (BFA) لمنع إفراز السيتوكين

1. حقن 250 ميكروغرام من BFA في 200 ميكرولتر من PBS داخل الصفاق لمدة 6 ساعات قبل التضحية بالفأر باستخدام حقنة أنسولين 29 G.
   ملاحظه: يتم تعليق BFA المجفف بالتجميد أولا في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لتحضير مخزون بتركيز 25 مجم / مل. ثم يتم تخفيف BFA في PBS في درجة حرارة الغرفة (RT) لتجنب التبلور قبل الحقن. يؤدي تثبيط إفراز السيتوكين إلى تراكم IFNγ في الخلايا. هذا أمر بالغ الأهمية للكشف عن السيتوكين.

< ص الفئة = "jove_title" >4. حصاد الطحال

1. قتل الفئران باستخدام تركيزات متزايدة من ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بخلع عنق الرحم.
   ملاحظه: اتبع إرشادات المؤسسة المحلية للقتل الرحيم الإنساني للفئران.
2. نظف البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وقم بعمل شق بالمقص لعمل قطع 1-2 سم من خلال الجلد على الجانب الأيسر من الفأر ، حيث يوجد الطحال. قم بعمل شق في الصفاق بعناية لفضح الطحال وإخراجه بالملاقط. احصد الطحال ، مع الحرص على عدم الضغط عليه بالملقط أو قطعه لتجنب تعطيل بنية الطحال.

< p class = "jove_title" >5. تثبيت الطحال مع بارافورمالدهيد (PFA)

1. تحضير المحلول المثبت عن طريق خلط 3.75 مل من PBS و 3.75 مل من 0.2 M L-lysine. أضف 21 ملجم من الصوديوم م بريدات واخلط جيدا. ثم أضف 2.5 مل من 4٪ PFA و 20 ميكرولتر من 12 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم
   ملاحظه: استخدم المحلول المثبت في نفس اليوم وتخلص من الفائض. لا تقم بتخزينه. خطوة التثبيت هذه مهمة إذا كانت العينة تحتوي على بروتينات فلورية مثل GFP. لا تستخدم PFA الذي يحتوي على آثار من الميثانول ، لأنه يفسد بروتينات الفلورسنت.
   أنذر: PFA سام ويجب التعامل معه بحذر.
2. اغمر الطحال في المثبت وثبته لمدة لا تقل عن 4 ساعات ، عادة 16-20 ساعة عند 4 درجات مئوية تحت التحريض اللطيف.
3. تخلص من محلول التثبيت وأضف 5 مل من PBS لمدة 5 دقائق في RT تحت تحريض لطيف.
4. استبدل PBS ب 5 مل من PBS الطازج واحتضانه لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية تحت تحريك لطيف.
5. استبدل PBS ب 5 مل من السكروز بنسبة 30٪ ، واحتضانه لمدة 12-24 ساعة
   ملاحظه: تساعد هذه الطريقة في الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة. بعد الحضانة بمحلول السكروز ، يجب أن يغرق العضو في قاع البئر.

6. التجميد والتقسيم

1. ضع الثلج الجاف في وعاء كبير وضع وعاء أصغر بداخله يحتوي على حوالي 50 مل من الميثانول النقي وبضع قطع من الثلج الجاف.
2. جفف الطحال برفق بمنديل خال من النسالة.
3. ضع الطحال داخل قالب أساسي يحتوي على قطرة من مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) في الأسفل. احرص على عدم إنتاج أي فقاعات. أضف OCT فوق الطحال.
4. باستخدام الملقط ، قم بإيداع القالب الأساسي على سطح الميثانول ، مع التأكد من أنه لا يلمس OCT. تجميد الأنسجة في أسرع وقت ممكن لتقليل القطع الأثرية.
5. عندما يتم تجميدها ، تابع التقسيم.
   ملاحظه: يمكن الاحتفاظ بالطحال المجمد عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
6. قسم الأنسجة باستخدام ميكروتوم بالتبريد.
   1. اضبط درجة حرارة الغرفة على ناظم البرد على -21 درجة مئوية. قطع أقسام من السماكة المطلوبة (عادة حوالي 10 ميكرومتر). يعمل هذا البروتوكول بسماكات تصل إلى 30 ميكرومتر.
7. اجمع الأقسام على شرائح المجهر الزجاجي (انظر جدول المواد) وافحص بصريا.
   ملاحظه: يمكن الاحتفاظ بالأقسام عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر.

فئة < p = "jove_title" >7. تلطيخ الفلورسنت المناعي

1. اسمح للقسم بالوصول إلى RT.
2. ارسم دائرة باستخدام مانع سائل (على سبيل المثال ، قلم عنق الرحم) حول قسم الأنسجة. ارسم خارج OCT وإلا فلن يلتصق.
3. بمجرد أن تجف ، أعد ترطيب العينة عن طريق وضع PBS على قسم المناديل لمدة 5 دقائق < br / > ملاحظه: يعتمد الحجم الموضوع في القسم على حجم القسم. نستخدم عادة 100-300 ميكرولتر. لا تدع الأقسام تجف بمجرد إعادة ترطيبها.
4. اشطفها باستخدام PBS مرتين على الأقل للتأكد من أن القسم ملتصق جيدا بالشريحة.
5. أضف محلول مانع إلى القسم لتقليل الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة.
   1. تحضير محلول الحجب على النحو التالي: PBS مع 0.1٪ Triton X100 ، 2٪ مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) ، 2.5 ميكروغرام / مل مانع مستقبلات Fc (مضاد للفأر CD16 / 32). ثم أضف 2-5٪ مصل طبيعي من أنواع كل جسم مضاد ثانوي للوحة التلوين.
      ملاحظه: إذا كانت الأجسام المضادة مترافقة / بيوتينيل مباشرة ، أضف مصل طبيعي بنسبة 5٪ من أنواع كل جسم مضاد أولي. إذا كان الجسم المضاد الأولي وأحد الأجسام المضادة الثانوية من نفس النوع (على سبيل المثال ، الجسم المضاد الأولي الذي يتم تربيته في الأرانب ومضاد للأرانب الثانوية ، فلا تستخدم أنواع المصل الطبيعية لأنها ستزيد من إشارة الخلفية.
   2. قم بإزالة PBS برفق من القسم عن طريق الشفط وأضف 100 ميكرولتر من محلول الحجب لكل قسم عينة. احتضن في غرفة مبللة مغطاة لمدة لا تقل عن 1 ساعة في RT.
6. وصمة عار بالأجسام المضادة الأولية.
   1. تمييع الأجسام المضادة الأولية بالتركيز الأمثل في محلول الحظر. تركيز الجسم المضاد لنقطة البداية العام هو 5 ميكروغرام / مل ، ولكن يجب تحسينه لكل جسم مضاد وأنسجة.
      ملاحظه: إذا كانت الأجسام المضادة مترافقة مباشرة ، فقم بالطرد المركزي لمزيج الأجسام المضادة عند 17.135 × جم (13.500 دورة في الدقيقة) لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية قبل استخدامه. يمكن أن تترسب الفلوروفور. ستعمل هذه الخطوة على تكوير الرواسب وبالتالي منع الترسب غير المحدد للأجسام المضادة المترسبة على الشريحة.
   2. استبدل محلول الحجب بمزيج الأجسام المضادة الأولية لكل عينة.
   3. احتضن لمدة 4 ساعات في RT أو بين عشية وضحاها (OVN) عند 4 درجات مئوية في غرفة مبللة مغطاة.
7. أداء الغسيل.
   1. قم بإعداد Wash Buffer عن طريق إضافة 2٪ FCS إلى PBS.
   2. اغسل 4 مرات باستخدام مخزن الغسيل: واحدة سريعة (بدون حضانة) ، وواحدة لمدة 10 دقائق ، واثنتان لمدة 5 دقائق. ثم قم بإجراء غسل نهائي باستخدام PBS لمدة 5 دقائق.
8. تلطيخ بالأجسام المضادة الثانوية.
   1. تمييع الأجسام المضادة الثانوية ذات الأهمية بالتركيز الأمثل في محلول الحظر. الطرد المركزي المزيج ، كما هو موضح للأجسام المضادة الأولية.
   2. قم بإزالة محلول الغسيل النهائي. أضف مزيج الجسم المضاد الثانوي أعلى القسم واحتضنه لمدة 1-4 ساعات في RT في غرفة مبللة مغطاة.
9. اغسل 4 مرات باستخدام مخزن الغسيل: واحدة سريعة (بدون حضانة) ، وواحدة لمدة 10 دقائق ، واثنتان لمدة 5 دقائق. ثم قم بإجراء غسل نهائي باستخدام PBS لمدة 5 دقائق.
10. قم بإزالة محلول الغسيل النهائي. اسمح ل PBS بالتبخر ولكن لا تفرط في تجفيف القسم. ضع قطرة من وسط التثبيت أعلى العينة وضع زجاج الغطاء فوقها بحذر. يجب أن يستعيد وسيط التركيب القسم بأكمله. دعها بوليميراز OVN في RT محمية من الضوء.
    ملاحظه: ارسم دائرة حول القسم الموجود على الجانب الخلفي من الشريحة قبل تطبيق وسيط التثبيت. بمجرد تطبيق وسط التثبيت ، قد يصبح من الصعب رؤية الأنسجة.
11. قم بتخزين الشرائح في الظلام عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للتصوير.

< p class = "jove_title" >8. التصوير والتحليل

1. قم بإجراء تصوير التلوين باستخدام مجهر متحد البؤر.
   ملاحظه: في هذا البروتوكول ، تم استخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر الطيفي المقلوب (انظر جدول المواد) ، جنبا إلى جنب مع الأهداف 10x / NA 0.40 أو 60x / NA 1.4 (لتحليل توطين السيتوكين الخلوي الفرعي). يتم عرض الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث لكل بروتين فلوروفور وفلورسنت في جدول المواد.
2. إجراء التحليل والقياس الكمي كما هو مطلوب باستخدام برامج معالجة الصور (على سبيل المثال ، Imaris أو Fiji).

المواد