تنقية وتنشيط الصفائح الدموية من دم الفئران الكامل

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Narciso ، M. G. ، وآخرون. تنقية الصفائح الدموية من دم الفأر. J. Vis. Exp. (2019).

في هذا الفيديو ، نصف بروتوكولا لتنقية الصفائح الدموية من دم الفئران الكامل وتنشيطها اللاحق باستخدام الثرومبين ناهض الصفائح الدموية. عند تحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي ، يتم تمييز الصفائح الدموية المنقاة بناء على التعبير عن علامة سطح الخلية CD41 ، في حين أن الصفائح الدموية المنشطة المنقاة تشارك في التعبير عن كل من علامات السطح CD41 و CD62P.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تنقية الصفائح الدموية

ملاحظة: يجب إجراء تنقية الصفائح الدموية في درجة حرارة الغرفة لمنع تدهورها. تأكد من أن درجة حرارة الكواشف والأدوات تتراوح بين 18 إلى 22 درجة مئوية. لمنع تدهور الصفائح الدموية ، يجب تجنب سحب العينة السريع والاهتزاز القوي أثناء الإجراء.

1. أضف 600 ميكرولتر من وسط التدرج iohexol (12٪ مسحوق iohexol في 0.85٪ كلوريد الصوديوم ، 5 ملي متريسين ، درجة الحموضة 7.2) في أنبوب 1.5 مل.
2. أضف 200 ميكرولتر من عينة الدم ببطء أسفل جانب الأنبوب أعلى وسط التدرج بطرف ماصة عريض التجويف حتى لا يختلط الدم ووسط iohexol (الشكل 1 أ).
3. جهاز الطرد المركزي للعينة المحتوية على أنبوب عند 400 × جم لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية في دوار دلو متأرجح مع تسارع وتباطؤ بطيئين.
4. اجمع معظم الطبقة الغنية بالصفائح الدموية وجزءا صغيرا من الطبقة الفقيرة بالصفائح الدموية (إجمالي 300 إلى 400 ميكرولتر) باستخدام طرف ماصة عريض التجويف دون إزعاج طبقات كرات الدم الحمراء وكرات الدم البيضاء (الشكل 1 ب). انقل عينة الصفائح الدموية إلى أنبوب جديد.
   ملاحظه: إذا كان عدد الصفائح الدموية أقل في الدم أو تم استخدام كمية أقل من الدم ، فيمكن اعتبار الطبقة الغنية بالصفائح الدموية والطبقة الفقيرة بالصفائح الدموية طبقة واحدة.
5. أضف 1 مل من PBS إلى عينة الصفائح الدموية ، واخلطها عن طريق الرجوع ، وأجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية في دوار دلو متأرجح. تخلص من المحلول تماما وأضف 200 ميكرولتر من PBS لإعادة تعليق الصفائح الدموية بسحب خفيف.
   ملاحظه: هذه الخطوة اختيارية ، لأنها تزيل الوسط المتدرج وبروتينات البلازما وتزيد من حساسية الصفائح الدموية للناهضات مثل الثرومبين. نظرا لأن أجهزة الطرد المركزي المختلفة لها برامج مختلفة ، يمكن تحديد التسارع / التباطؤ البطيء من خلال قراءة دليل المستخدم الخاص بجهاز الطرد المركزي.
6. انقل 30 ميكرولتر من هذه العينة إلى أنبوب جديد لحساب الصفائح الدموية. يمكن استخدام الصفائح الدموية المتبقية في المقايسات الكيميائية الحيوية والفسيولوجية مثل تنشيط الصفائح الدموية ، والتجميع ، وإطلاق الحبيبات ، وما إلى ذلك.
7. لاستخراج الحمض النووي الريبي أو البروتين ، قم بالطرد المركزي لعينة الصفائح الدموية عند 800 × جم لمدة 10 دقائق لحبيبات الصفائح الدموية. تخلص من المادة الطافية تماما دون إزعاج الحبيبات. أضف الحجم المطلوب من الحمض النووي الريبي أو محلول تحلل البروتين لتحلل الصفائح الدموية.

فئة

2. تنشيط الصفائح الدموية

1. في أنبوب، أضف 1 إلى 2 مليون صفيحة صفيحية منقاة في ما يصل إلى 100 ميكرولتر من محلول التلوين (PBS مع مصل بقري جنيني 2٪، FBS).
2. لعدد متعدد من العينات ، قم بعمل مزيج رئيسي من الأجسام المضادة مع 1 ميكرولتر (0.5 مجم / مل) مما يلي: الفئران PE-Cy7 المضادة للفأر TER 119 ، والفئران PE المضادة للفأر CD45 ، والجرذان FITC المضادة للفأر CD41 ، والفئران APC المضادة للفأر / CD62P البشري (P-selectin) للكشف عن كرات الدم الحمراء ، وكرات الدم البيضاء ، والصفائح الدموية ، والصفائح الدموية المنشطة ، على التوالي. أضف المزيج الرئيسي إلى الأنابيب لتلوين الخلايا. لا تضيف الثرومبين.
3. في أنبوب آخر ، أضف 1 إلى 2 مليون صفيحة منقاة في ما يصل إلى 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلوين ، و 0.4 ملي مولار GPRP الببتيد. أضف الثرومبين لتنشيط الصفائح الدموية وتلطيخ الخلايا باتباع الخطوة 2.2.
   ملاحظه: يجب إضافة GPRP إلى العينة قبل إضافة الثرومبين لمنع تكوين الركام أو الجلطة من خلال تنشيط الصفائح الدموية. يجب تحسين تركيز الثرومبين للحصول على تنشيط جيد للصفائح الدموية. بعد تنشيط الصفائح الدموية ، يتم تقليل عدد الأحداث أثناء الحصول على العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي.
4. كعنصر تحكم إيجابي ، أضف 1 ميكرولتر من الدم الكامل في ما يصل إلى 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ في أنبوب وببتيد GPRP 0.4 ملي. أضف الثرومبين لتنشيط الصفائح الدموية. كعنصر تحكم سلبي ، أضف 1 ميكرولتر من الدم الكامل في ما يصل إلى 100 ميكرولتر من محلول التلوين. لا تضيف الثرومبين إلى عينة التحكم السلبية. تلطخ الخلايا باتباع الخطوة 2.2.
5. للتحكم في النمط المتشاوي لقياس التدفق الخلوي ، قم بتسمية 5 أنابيب ب PE-Cy7 و PE و FITC و APC غير ملوثة. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلوين ، و 1 ميكرولتر من الدم ، و 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المعني إلى الأنابيب المسماة لتلطيخ الخلايا.
6. احتضن العينات لتلطيخ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
7. اغسل العينات بإضافة 1 مل من محلول التلوين إلى كل أنبوب. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المخزن المؤقت للتلطيخ بعناية دون إزاحة الحبيبات.
8. أضف 300 ميكرولتر من مخزن التلوين إلى كل أنبوب ، واخلطه برفق ، ثم انقله إلى أنبوب FACS. قم بتخزين العينات الملطخة في الظلام حتى يتم تحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1. دم الفأر قبل وبعد الطرد المركزي باستخدام وسيط التدرج Iohexol. (أ) يشكل اليوهكسول والدم طبقتين منفصلتين قبل الطرد المركزي إذا تمت إضافة عينة الدم بعناية. تعرض اللوحة اليسرى مخططا تخطيطيا وتعرض اللوحة اليمنى الصورة الفعلية. (ب) تظهر أربع طبقات منفصلة بعد الطرد المركزي للدم الكامل بوسط متدرج. تعرض اللوحة اليسرى مخططا تخطيطيا للطبقات وتعرض اللوحة اليمنى الصورة الفعلية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات APC الفئران المضادة للفأر / البشرية CD62P
(P-selectin) علم الحرارة 17-0626-82 علامة تنشيط الصفائح الدموية أنبوب Eppendorf فيشر ساينتيك 14-222-166 أنبوب لأجهزة الطرد المركزي مصل الأبقار الجنينية (FBS) إنفيتروجين 26140079 مكون لتلطيخ العازلة FITC الفئران المضادة للفأر CD41 BD Biosciences 553848 علامة الصفائح الدموية Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) EMD ميليبور 03-34-0001 منع تكون جلطة الصفائح الدموية أطراف ماصة 1000 ميكرولتر، واسعة التجويف ثيرموفيشر العلمي 21-236-2 ج نقل عينات الدم والصفائح الدموية PE الفئران المضادة للفأر CD45 BD Biosciences 561087 علامة WBC PE-Cy7 الفئران المضادة للفأر TER 119 BD Biosciences 557853 علامة كرات الدم الحمراء أطراف الماصات 200 ميكرولتر، واسعة التجويف ثيرموفيشر العلمي 21-236-1 أ نقل عينات الدم والصفائح الدموية محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثيرموفيشر العلمي 14040-117 عازلة للغسيل والتخفيف تلطيخ المخزن المؤقت داخلي عنصر غير كتالوج عازلة الغسيل والتخفيف الثرومبين مختبر أبحاث الإنزيم HT 1002a ناهض تنشيط الصفائح الدموية كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش إس 7653 محلول ملحي فسيولوجي جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة ثيرموفيشر العلمي 75253839 / 433607 جهاز طرد مركزي دوار دلو متأرجح تريسين سيجما ألدريتش تي 0377 المخزن المؤقت لوسط Nycodenz أنبوب FACS فيشر ساينتيك 352008 أنابيب لقياس التدفق الخلوي