تنقية وتنشيط الصفائح الدموية من دم الفئران الكامل

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Narciso ، M. G. ، وآخرون. تنقية الصفائح الدموية من دم الفأر. J. Vis. Exp. (2019).

في هذا الفيديو ، نصف بروتوكولا لتنقية الصفائح الدموية من دم الفئران الكامل وتنشيطها اللاحق باستخدام الثرومبين ناهض الصفائح الدموية. عند تحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي ، يتم تمييز الصفائح الدموية المنقاة بناء على التعبير عن علامة سطح الخلية CD41 ، في حين أن الصفائح الدموية المنشطة المنقاة تشارك في التعبير عن كل من علامات السطح CD41 و CD62P.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تنقية الصفائح الدموية

ملاحظة: يجب إجراء تنقية الصفائح الدموية في درجة حرارة الغرفة لمنع تدهورها. تأكد من أن درجة حرارة الكواشف والأدوات تتراوح بين 18 إلى 22 درجة مئوية. لمنع تدهور الصفائح الدموية ، يجب تجنب سحب العينة السريع والاهتزاز القوي أثناء الإجراء.

1. أضف 600 ميكرولتر من وسط التدرج iohexol (12٪ مسحوق iohexol في 0.85٪ كلوريد الصوديوم ، 5 ملي متريسين ، درجة الحموضة 7.2) في أنبوب 1.5 مل.
2. أضف 200 ميكرولتر من عينة الدم ببطء أسفل....

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1. دم الفأر قبل وبعد الطرد المركزي باستخدام وسيط التدرج Iohexol. (أ) يشكل اليوهكسول والدم طبقتين منفصلتين قبل الطرد المركزي إذا تمت إضافة عينة الدم بعناية. تعرض اللوحة اليسرى مخططا تخطيطيا وتعرض اللوحة اليمنى الصورة الفعلية. (ب) تظهر أربع طبقات منفصلة بعد الطرد المركزي للدم الكامل بوسط متدرج. تعرض اللوحة اليسرى مخططا تخطيطيا للطبقات وتعرض اللوحة اليمنى الصورة الفعلية.

....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات APC الفئران المضادة للفأر / البشرية CD62P
(P-selectin) علم الحرارة 17-0626-82 علامة تنشيط الصفائح الدموية أنبوب Eppendorf فيشر ساينتيك 14-222-166 أنبوب لأجهزة الطرد المركزي مصل الأبقار الجنينية (FBS) إنفيتروجين 26140079 مكون لتلطيخ العازلة FITC الفئران المضادة للفأر CD41 BD Biosciences 553848 علامة الصفائح الدموية Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) EMD ميليبور 03-34-0001 منع تكون جلطة الصفائح الدموية أطراف ماصة 1000 ميكرولتر، واسعة التجويف ثيرموفيشر العلمي 21-236-2 ج نقل عينات الدم والصفائح الدموية PE الفئران المضادة للفأر CD45 BD Biosciences 561087 علامة WBC PE-Cy7 الفئران المضادة للفأر TER 119 BD Biosciences 557853 علامة كرات الدم الحمراء أطراف الماصات 200 ميكرولتر، واسعة التجويف ثيرموفيشر العلمي 21-236-1 أ نقل عينات الدم والصفائح الدموية محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثيرموفيشر العلمي 14040-117 عازلة للغسيل والتخفيف تلطيخ المخزن المؤقت داخلي عنصر غير كتالوج عازلة الغسيل والتخفيف الثرومبين مختبر أبحاث الإنزيم HT 1002a ناهض تنشيط الصفائح الدموية كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش إس 7653 محلول ملحي فسيولوجي جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة ثيرموفيشر العلمي 75253839 / 433607 جهاز طرد مركزي دوار دلو متأرجح تريسين سيجما ألدريتش تي 0377 المخزن المؤقت لوسط Nycodenz أنبوب FACS فيشر ساينتيك 352008 أنابيب لقياس التدفق الخلوي