عزل خلايا سيرتولي التنظيمية المناعية عن الأنابيب المنوية للفأر

الملخص

المصدر: Bhushan ، S. et al. ، عزل خلايا سيرتولي والخلايا المحيطة بالأنابيب من خصيتين الفئران.J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو إجراء عزل خلايا سيرتولي عن الأنابيب المنوية للفأر ، وهي أحد مكونات الخصيتين. يعزز الهضم الأنزيمي والغسول المتكرر إطلاق خلايا سيرتولي في المحلول ، والتي يمكن زراعتها بشكل أكبر للتكاثر والنمو.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الوسائط ومحاليل الإنزيم

1. تحضير كحول اليود 1٪ عن طريق إذابة 1 غرام من اليود في 100 مل من الإيثانول.
2. تحضير 2 × 500 مل من محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS) من Dulbecco بدون Ca²⁺ و Mg²⁺ مع 7.5 مل من D-glucose (100 جم / لتر) و 5 مل 100 × محلول مخزون البنسلين / الستربتومايسين (15 مجم / مل D-glucose و 50 U / مل البنسلين و 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين النهائي).
3. ملحق 1 × 500 مل معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 متوسط مع 5 مل 100 × محلول مخزون البنسلين / الستربتومايسين (50 وحدة / مل بنسلين و 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين النهائي).
4. قم بإعداد محلول Trypsin-DNase I (2.5 مجم / مل من التربسين و 10 ميكروغرام / مل من DNase I) عن طريق إضافة 25 مجم من التربسين و 0.1 مل من DNase I (1 مجم / مل DNase I) إلى 9.9 مل من PBS.
5. قم بإذابة مثبط التربسين 50 مجم في 5 مل PBS لمثبط التربسين A (10 مجم / مل). قم بإذابة مثبطات التربسين 25 ملغ في 10 مل PBS لمحلول مثبط التربسين B (2.5 ملغ/مل).
6. للحصول على محلول كولاجيناز-هيالورونيداز-ديوكسيربونوكلياز I (DNase I) يذوب 10 ملغ كولاجيناز أ (1 ملغ/مل نهائي) و10 ملغ هيالورونيداز (1 ملغ/مل نهائي) و0.1 مل DNase I (1 ملغ/مل DNase I) (10 ميكروغرام/مل نهائي) في 10 مل PBS.
7. قم بإعداد محلول Hyaluronidase-DNase I عن طريق إضافة 10 مجم من الهيالورونيداز (1 مجم / مل نهائي) و 0.1 مل من محلول DNase I (1 مجم / مل) (10 ميكروغرام / مل نهائي) إلى 9.9 مل PBS.
8. اطلب فئران Wistar في الوقت المحدد بحيث يبلغ عمرها 19 يوما في يوم عزل خلية Sertoli.
   ملاحظه: تم تصميم البروتوكول الموصوف ل 10 فئران ولكن يمكن تعديله لمدة لا تقل عن 5 فئران و 20 فأرا كحد أقصى. يجب تعديل أحجام جميع الحلول وفقا لذلك.
   في البروتوكول التالي ، تشير "الماصة" إلى الماصة المصلية.

< p class = "jove_title" >2. تحضير الأنابيب المنوية

1. قم بتخدير 10 ذكور من فئران الويستار واحدة تلو الأخرى في مجفف باستخدام ثاني أكسيد الكربون₂ ومعدل تدفق يزيح ما لا يقل عن 20٪ من حجم الغرفة في الدقيقة. انتظر حتى يتوقف التنفس ، واختبر التخدير عن طريق الضغط على وسادة القدم ، وإذا لم يكن هناك رد فعل ، فقم بالقتل الرحيم لكل فأر عن طريق خلع عنق الرحم. تصريف الدم عن طريق تقسيم الوريد الوداجي والشريان السباتي (المهبل الكاروتي) تحت الماء المتدفق. تطهير البطن عن طريق مسحه بنسبة 70٪ من الإيثانول.
2. باستخدام الملقط ، ارفع الجلد من عضلات البطن وقطع فص الجلد البيضاوي الشكل الذي يمتد من ارتفاق العانة إلى القص (الشكل 1 أ) ورفرفه لأعلى على الصدر. بعد ذلك ، أمسك عضلات البطن وقم بعمل شق وسطي من ارتفاق العانة إلى القص.
   1. اضغط على البطن بالإبهام من الحوض لأعلى لدفع الخصيتين للخروج من أسفل الحوض. اختر وسادة الدهون البربخية (الشكل 1 ب) بالملقط لسحب الخصية بشكل أكبر. اقطع الحبل المنوي (الشكل 1 ب) ، تاركا الغلالة البوغينيا سليمة ، واجمع جميع الخصيتين في 20 مل PBS في أنبوب مخروطي 50 مل (الشكل 1 ج).
3. بعد جمع جميع الخصيتين ، قم بتطهيرها بإضافة حجم متساو (20 مل) من 1٪ (وزن / حجم) من اليود في الإيثانول. اقلب الأنبوب مرتين وصب المادة الطافية على الفور. اغسل الخصيتين بسرعة مرتين باستخدام 25 مل من PBS لكل منهما (الشكل 1 د).
4. انقل الخصيتين إلى طبق بتري يحتوي على 15 مل من PBS (الشكل 1 ه). أمسك كل خصية بإحكام بالملقط في أحد طرفيه ، وقم بعمل شق صغير في الغلالة البيضاء في الطرف الآخر ، واضغط على الأنابيب باستخدام شفرات مقصية مغلقة كأداة كشط.
   ملاحظه: يجب أن تظل الأنابيب تشكل حزمة مضغوطة على شكل خصية مع عدد قليل من الأنابيب الممتدة إلى المحلول من أجل تمكين الهضم الأنزيمي المتجانس (الشكل 1F).
5. انقل الخصيتين غير الكبسولتين إلى زجاجة ذات غطاء لولبي سعة 100 مل تحتوي على محلول Trypsin-DNase I سعة 10 مل. قم بإجراء عملية الهضم في حمام مائي مهتز عند 32 درجة مئوية (120 تذبذب / دقيقة). بعد 4 دقائق ، قم بتقييم الأنابيب بالعين المجردة لتشتت الأنابيب. بمجرد أن تبدأ الأنابيب في التشتت في المحلول ، أوقف عملية الهضم على الفور. إذا لزم الأمر ، استمر في الحضانة لمدة تصل إلى 2 دقيقة.
6. أوقف هضم التربسين عن طريق إضافة 5 مل من محلول مثبط التربسين أ. امزج المحلول جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 3-4 مرات باستخدام ماصة سعة 10 مل وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
7. بعد 5 دقائق من الحضانة ، لاحظ أن الأنابيب تستقر بوحدة الجاذبية ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة 10 مل من الخطوة 2.6 ، وأضف 10 مل من محلول مثبط التربسين B من أجل إيقاف هضم التربسين تماما. أعد تعليق الأنابيب عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 2-3 مرات.
8. من أجل إزالة الخلايا الخلالية الملوثة ، اغسل الأنابيب 9 مرات مع 25 مل من PBS لكل منها. أعد تعليق الأنابيب في كل غسلة باستخدام ماصة سعة 25 مل واتركها تستقر بوحدة الجاذبية لمدة 10 دقائق. استخدم دائما نفس الماصة سعة 25 مل لسحب الماصة PBS وإعادة التعليق وإزالة المادة الطافية.

< p class = "jove_title" >3. إزالة / عزل الخلايا المحيطة بالأنابيب (PTCs)

1. انقل جميع الأنابيب إلى زجاجة ذات غطاء لولبي سعة 100 مل وأضف محلول Collagenase-Hyaluronidase-DNase I (الشكل 2 أ). قم بإجراء عملية الهضم لمدة 10 دقائق في حمام مائي مهتز عند 32 درجة مئوية (120 تذبذب / دقيقة).
2. قم بإخراج قطرة من التعليق على شريحة زجاجية وتحقق بسرعة من الأنابيب تحت مجهر ضوئي مقلوب لزراعة الخلايا الروتينية بتكبير 100 ضعف. إذا لم يكن الهضم متقدما بدرجة كافية ، فاستمر في الحضانة لمدة دقيقتين إضافيتين (لا تحسب الوقت اللازم للفحص المجهري).
   ملاحظه: خلال هذه الخطوة ، يتم تقصير طول جميع الأنابيب ويجب أن تصبح حواف الأنابيب خشنة (الشكل 2 ب و ج). الحواف الخشنة تدل على إطلاق الخلايا المحيطة بالأنبوب.
3. انقل المعلق مع الأنابيب المهضومة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل باستخدام ماصة سعة 25 مل من الخطوة 2.8. اغسل الزجاجة سعة 100 مل مع 10 مل PBS وأضفها إلى الأنابيب الموجودة في الأنبوب المخروطي. اسمح للأنابيب المهضومة بالاستقرار بوحدة الجاذبية لمدة 10 دقائق ، وشفط المادة الطافية بعناية ، التي تحتوي على PTCs ، باستخدام الماصة سعة 25 مل مرة أخرى ، وانقلها إلى أنبوب مخروطي جديد. لشفط المليلتر الأخير ، استخدم ماصة سعة 5 مل لمنع أي ترحيل للأنيوب.

< p class = "jove_title" >4. عزل خلايا سيرتولي (SCs)

1. أعد تعليق الأنابيب المستقرة من الخطوة 3.3 جيدا في 25 مل من PBS باستخدام ماصة سعة 25 مل واتركها تستقر بوحدة الجاذبية لمدة 12 دقيقة. استخدم نفس الماصة سعة 25 مل لسحب الأنابيب PBS وإعادة تعليق الأنابيب وإزالة المواد الطافية كرر الغسيل 3 مرات (4 غسلات في المجموع).
2. بعد الغسيل الأخير ، انقل الأنابيب المهضومة إلى زجاجة أخرى ذات غطاء لولبي سعة 100 مل تحتوي على محلول Hyaluronidase-DNase I. قم بإجراء عملية الهضم في حمام مائي مهتز عند 32 درجة مئوية (120 تذبذب / دقيقة).
3. بعد 5 دقائق ، تحقق من الأنابيب مرة أخرى عن طريق الفحص المجهري الضوئي بتكبير 100X كما هو موضح في الخطوة 3.2.
   ملاحظه: يجب أن تكون الأنابيب القصيرة والركام الأنبوبي والخلايا المنبعثة مرئية (الشكل 2 د).
   1. اترك الركام الأنبوبي يستقر لمدة 10 دقائق، وشفط المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 25 مل. اغسل الركام 4 مرات باستخدام 25 مل PBS ووقت ترسيب 10 دقائق لكل خطوة غسيل (الشكل 2E).
4. أضف 20 مل من متوسط RPMI 1640 وقم بتمرير التعليق 10 مرات من خلال إبرة 18 جم مثبتة على حقنة سعة 20 مل. تجنب فقاعات الهواء.
   ملاحظه: يعتبر سحب التعليق للداخل والخارج من خلال الإبرة بمثابة تمريرة واحدة. يعد تعطيل الخلايا وتجانسها عن طريق القص الهيدروديناميكي تقنية قياسية في تحضير الخلايا التي تميل إلى التجميع. من غير المرجح أن يكون لمرور الخلايا عبر إبرة تحت الجلد ذات قطر داخلي صغير تأثير على خصائصها الوظيفية. يوضح الشكل 3C و D البنية التحتية الطبيعية لخلايا سيرتولي المنقاة في اليوم 4 من الثقافة.
   1. قم بإخراج قطرة من التعليق على شريحة زجاجية وتحقق بسرعة من الأنابيب تحت مجهر ضوئي مقلوب لزراعة الخلايا الروتينية بتكبير 10 أضعاف إذا كانت جميع الركام مشتتة (الشكل 2F). قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر من أجل الحصول على تعليق نقي أحادي الخلية في المرشح.
قم
5. بالطرد المركزي لمرشح الخطوة 4.4 عند 200 × جم لمدة 10 دقائق عند RT دون استخدام الكسر. قم بشفط المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة سعة 25 مل، وأعد تعليق خلايا سيرتولي في 40 مل RPMI 1640 متوسطة (خالية من المصل).
6. امزج معلق الخلية 100 ميكرولتر مع 100 ميكرولتر من Trypan Blue Stain وعد الخلايا باستخدام غرفة Neubauer المحسنة. اضبط تركيز الخلية على 3 × 10⁶ خلايا / مل وفقا لنتيجة العد. بذرة 1 مل لكل بئر على طبق من 6 آبار (= اليوم 1). ملاحظه: تستقر خلايا سيرتولي في التعليق بسرعة ، لذا يجب اهتزاز الأنبوب لفترة وجيزة في كل مرة قبل أخذ حصة الخلية مع الماصة. حتى اليوم 4 يعلقون بقوة على الطبقة السفلية.

النتائج

الشكل 1. يتم استئصال الخصيتين من فئران ويستار ونزع الكفسولة.(أ) يتم فتح التجويف البريتوني من خلال شق طولي كما هو موضح في النص. تشير علامة النجمة (*) إلى وسادة الدهون البربخية. (ب) تتم إزالة الخصيتين عن طريق قطع الحبل المنوي و (ج) يتم جمعها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 20 مل من PBS. عندما يتم جمع جميع الخصيتين ، يتم تطهيرها في 20 مل من 1٪ (وزن / حجم) من اليود في الإيثانول. لإزا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مصافي خلية كورنينج™ 70 ميكرومتر كورنينج 431751 اللون الأبيض حامل DAPI ProLong® Gold Antifade تقنيات الحياة ف -36931 د-الجلوكوز سيغما جي 8644 100 جم / لتر Dulbecco's PBS بدون Ca2 + / Mg2 + جيبكو 14190-094 DNase I روش 10104159001 الهيالورونيداز من الخصية البقرية سيغما H3506 البنسلين (5,000 وحدة / مل) ستربتومايسين (5,000 ميكروغرام / مل) جيبكو 15070-063 حل 100x RPMI-1640 جيبكو هاتف: 21875-034 يحتوي على 300 ملغم/لتر من الجلوتامين التربسين من البنكرياس الخنازير سيغما تي 5266 تريبان بلو ستين (0.4٪) جيبكو 15250-061 مثبط التربسين من فول الصويا سيغما تي 6522 منتج Sigma أرخص بكثير من BPTI (Aprotinin) المستخدم سابقا من Roche. فئران ويستار WU نهر تشارلز غير متاح يجب أن يكون عمره 19 يوما في يوم التجربة.