العزل الانتقائي للخلايا التائية CD4 + Vδ1 + γδ من خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة

الملخص

المصدر: Welker, C., et al. العزل وخارج الجسم الحي ثقافة الخلايا التائية Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ γδ ، وهو سلف لخلايا αβT خارج الوكت. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا للعزل القائم على الملصقات المغناطيسية لمجموعة منخفضة التركيز من الخلايا التائية CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ من خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة (PBMCs). باستخدام مزيج من الأجسام المضادة المضادة ل Vδ1 المترافقة ب FITC ، والميكروبيدات المغناطيسية المضادة ل FITC ، والخرز المغناطيسي الفائق المغلفة بالأجسام المضادة ل CD4 ، يمكن تنقية الخلايا التائية CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ بنجاح من مجموعة PBMC.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

1. عزل الخلايا التائية Vδ1

1. خذ <1 × 10⁶ خلايا ليمفاوية معزولة للحصول على FACS أولي يحدد تردد خلايا Vδ1 CD4 T.
   ملاحظه: قد يختلف حجم سكان كيان الخلايا التائية هذا اختلافا كبيرا بين الأفراد ووفقا لحالتهم المناعية. عادة ما يكون حوالي 1٪ من الخلايا التائية هي Vδ1⁺ وحوالي 1-5٪ من خلايا Vδ1⁺ هي CD4⁺.
   1. قم بتخفيف الخلايا باستخدام 1 مل من FACS ، والذي يتكون من PBS يحتوي على 2٪ FCS و 5 ملي EDTA. جهاز الطرد المركزي عند 660 × جم لمدة دقيقتين وصب المادة الطافية. حجم الارتداد البالغ حوالي 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS كاف للتلوين اللاحق. قم بدوامة واحتضان الخلايا لفترة وجيزة باستخدام كاشف حجب FC سعة 5 ميكرولتر لمدة 5 دقائق في RT لزيادة خصوصية تلطيخ FACS.
   2. أضف الأجسام المضادة البشرية وحيدة النسيلة مباشرة إلى الخلايا دون إزالة كاشف حجب FC. تأكد من تلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة ضد Vδ1 (1:50) و CD3 (1:50) و CD4 (1:200) و CD8 (1:200) و TCRαβ (1:25). قم بإعداد التحكم في النمط المتماثل باستخدام الأنماط التماثلية للجلوبولين المناعي المقابلة. احتضان الخلايا بالأجسام المضادة لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
   3. اغسل الخلايا في مخزن مؤقت FACS سعة 1 مل (جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين ؛ عند 660 × جم) ، وصب المادة الطافية ، وانتقل إلى الحصول على FACS في حجم المخزن المؤقت المتبقي.
قم
2. بتكوير الخلايا (التي لا يتم استخدامها في تحليل FACS) عن طريق الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة ؛ عند 300 جم ؛ 8 درجة مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 60 ميكرولتر MACS-buffer لكل 1 × 10⁷ خلايا. أضف 20 ميكرولتر من كاشف حجب FC لكل 1 × 10⁷ خلايا واحتضانه لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
3. أضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد Vδ1 المضاد للإنسان المترافق مع FITC لكل 1 × 10⁷ خلايا مباشرة إلى الخلايا. احتضن لمدة 12 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
4. اغسل الخلايا باستخدام عازل MACS سعة 14 مل (جهاز طرد مركزي لمدة 12 دقيقة ؛ عند 300 جم ؛ 8 درجات مئوية). تخلص من المادة الطافية تماما وأعد تعليق الخلايا في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS لكل 1x10⁷ خلايا.
5. خذ 1-2 × 10⁵ خلايا وقم بتخفيفها في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS للتحقق من الملصقات عن طريق تحليل FACS. ليست هناك حاجة إلى مزيد من الإضافات لهذه الخطوة. تأكد من وجود فرق كاف في سطوع خلايا Vδ1^- و Vδ1⁺. إذا لم يكن الأمر كذلك، فكرر الخطوتين 1.3 و1.4.
6. أضف 20 ميكرولتر من الميكروبيدات المضادة ل FITC لكل 1 × 10⁷ خلايا إلى الخلايا المتبقية ، واخلطها جيدا ، واحتضنها لمدة 15 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، اغسل الخلايا باستخدام 10 مل على الأقل من MACS المؤقت (جهاز طرد مركزي لمدة 12 دقيقة ، عند 300 × جم ؛ 8 درجات مئوية).
7. أثناء الطرد المركزي ، قم بموازنة العمود المغناطيسي المبرد مسبقا الموضوع في مغناطيس مع 500 ميكرولتر من MACS عازلة.
8. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت MACS سعة 500 ميكرولتر (لأرقام الخلايا الأعلى من 1 × 10⁸ ، قم بتوسيع نطاق هذا الحجم وفقا لذلك) وقم بتطبيق الخلايا بعناية على العمود. اجمع التدفق الذي يحتوي على خلايا Vδ1.
9. اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من MACS المؤقت واجمع التدفق مرة أخرى في نفس الأنبوب. لاحظ أن الخزان يجب أن يكون فارغا قبل تطبيق المخزن المؤقت على العمود.
10. قم بإزالة العمود من الجهاز المغناطيسي وضعه في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. قم بمسح العمود بسرعة باستخدام مخزن مؤقت MACS سعة 1 مل عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود. اجمع التصفيص في أنبوب.
    ملاحظة: من أجل الحصول على نقاء >98٪ ، من الضروري عادة تكرار الخطوات 1.7-1.9 بعمود ثان.
11. تحقق من نقاء الخلايا عن طريق تحليل FACS بنفس لوحة الأجسام المضادة كما كان من قبل (انظر 1.1.2) وعد الخلايا.

فئة

2. عزل الخلايا التائية Vδ1CD4 ⁺

1. أعد تعليق 25 ميكرولتر من حبات CD4 بدوامة لمدة >30 ثانية. اغسل الخرزات (الحد الأدنى للكمية كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة) في 1 مل من المخزن المؤقت MACS في أنبوب تفاعل سعة 1.5 مل عن طريق وضع الأنبوب في مغناطيس لمدة 1 دقيقة. تخلص من المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة صغيرة الحجم (200 ميكرولتر) وأعد تعليق الخرزات في الحجم الأصلي للمخزن المؤقت لنظام التشغيل Macs.
2. قم بتكوير خلايا Vδ1⁺ (جهاز طرد مركزي لمدة 12 دقيقة ؛ عند 300 × جم) وشفط المادة الطافية وإعادة تعليق جميع خلايا Vδ1 ⁺ في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS وإضافتها إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخرز. تخلط بقوة وتحتضن لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية مع إمالة مستمرة (على سبيل المثال ، في المدور).
3. ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا في مغناطيس لمدة دقيقتين. تأكد من عدم وجود بقايا في الغطاء.
   ملاحظة: ستقوم خلايا CD4 ⁺ بربط الخرزات المغناطيسية وتثبيتها على جانب الأنبوب المواجه للمغناطيس.
4. افتح الغطاء بعناية مع إبقاء الأنبوب داخل الجهاز المغناطيسي واجمع المادة الطافية التي تحتوي على خلايا CD4-Vδ1⁺ باستخدام ماصة صغيرة الحجم. ضع خلايا CD4-Vδ1 ⁺ في أنبوب منفصل وضع هذا الأنبوب في المغناطيس مرة أخرى لتجنب خلايا CD4 أو الخرز المتبقي من السكان.
   1. اغسل خلايا CD4^- في مخزن مؤقت MACS سعة 5 مل (جهاز طرد مركزي لمدة 12 دقيقة ؛ عند 300 × جم) وأعد تعليقها بتركيز 1 × 10⁵ خلايا لكل 100 ميكرولتر من الوسائط. يمكن زراعة خلايا CD4- بسهولة في ظل ظروف مناسبة.
5. ضع الأنبوب مع أهداف خلية CD4 ⁺ خارج المجال المغناطيسي ، وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من MACS ، وأعدها إلى الجهاز المغناطيسي. كرر الخطوات 2.3-2.5 مرتين للحصول على نقاء أعلى. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق سحب العينات.
6. أعد تعليق خلايا CD4 ⁺ في وسط زراعة 100 ميكرولتر (RPMI 1640 ، 10٪ FCS ، 1٪ L-Glutamine ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين) وأضف 10 ميكرولتر من محلول فصل الخرز. احتضن في RT لمدة 45 دقيقة مع إمالة مستمرة (على سبيل المثال ، في المدور).
7. ضع الخلايا في مغناطيس لمدة 1 دقيقة. اجمع بعناية المادة الطافية التي تحتوي على خلايا Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ خالية من الخرز باستخدام ماصة صغيرة الحجم.
8. خارج المغناطيس ، أعد تعليق الخرزات بوسائط زراعة 100 ميكرولتر وكرر الخطوتين 2.6 و 2.7 مرتين للحصول على أعداد خلايا أعلى من خلايا CD4 ⁺.
9. قم بتكوير الخلايا (جهاز الطرد المركزي عند 300 × جم ، لمدة 12 دقيقة) وتخلص من المادة الطافية تماما عن طريق سحب العينات. أعد تعليق الخلايا في وسائط جديدة ودافئة مسبقا وقم بحسابها. افحص نقاء خلايا Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ عن طريق تحليل FACS الموضح في الخطوات 1.1.1-1.1.3.

المواد