تقنية في المختبر لتوليد مصائد العدلات البشرية خارج الخلية

الملخص

المصدر: Najmeh, S., et al. عزل ومعالجة مصائد العدلات البشرية المبسطة خارج الخلية (NETs). J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو تقنية في المختبر لتوليد وعزل مصائد العدلات خارج الخلية (NETs). يتم عزل العدلات من الدم المحيطي ويتم تحفيزها باستخدام أسيتات فوربول ميريستات (PMA) لإنتاج NETs. أثناء الحضانة ، تخضع العدلات لعملية موت الخلايا (NETosis) لإطلاق NETs التي تتكون من الكروماتين غير المكثف الممزوج ببروتينات السيتوبلازم الحبيبية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

1. توليد NETs

1. تحفيز العدلات ب 500 نانومتر من PMA (لكل 30 مل من محلول العدلات) واحتضانه على طبق زراعة أنسجة مسطح مقاس 150 × 25 مم مع شبكة 20 مم لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. هذا سيسمح ل NETosis.
2. بعد 4 ساعات من التحفيز ، قم بشفط الوسائط برفق وتخلص منها ، تاركا طبقة NETs والعدلات ملتصقة في الأسفل. لا تعطل هذه الطبقة.
3. باستخدام ما مجموعه 15 مل من PBS البارد بدون Ca و Mg لكل طبق ، اغسل قاع كل طبق عن طريق سحب 15 مل من PBS في قاع الطبق لرفع جميع المواد الملتصقة من القاع.
4. اجمع المحلول الذي تم الحصول عليه من غسل كل طبق (الخطوة 1.3) في أنبوب مخروطي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 450 × جم عند 4 درجات مئوية.
5. قسم المادة الطافية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل وتدور لمدة 10 دقائق عند 18,000 × جم عند 4 درجات مئوية. سيسمح ذلك لكل الحمض النووي بالحبيبات.
   ملاحظه: يعد الطرد المركزي في الأنابيب الأكبر أسهل وأقل استهلاكا للوقت إذا كان من الممكن تحقيق هذه السرعات العالية على جهاز الطرد المركزي العادي ، وإلا فستحتاج إلى تقسيم المواد الطافية إلى أنابيب أصغر من أجل استخدام أجهزة الطرد المركزي الدقيقة عالية السرعة.
6. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق جميع الكريات التي تم الحصول عليها معا في PBS المثلج إلى تركيز يعادل 2 × 10⁷ عدلات لكل 100 ميكرولتر من PBS. سيؤدي ذلك إلى إنتاج مخزون NET الخالي من الخلايا والذي يمكن استخدامه في التجارب اللاحقة.
7. قم بقياس تركيز الحمض النووي في العينة التي تم الحصول عليها باستخدام قياس الطيف الضوئي أو أداة قياس كمية الحمض النووي البديلة. يجب أن يتراوح التركيز الكافي في العينة بين 140 - 180 نانوغرام / ميكرولتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) من Dulbecco ، معدل ، بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم Wisent 311-425-CL RPMI-1640 متوسط مع L-glutamine Wisent 350-000-CL يتم تصنيع محلول 3٪ RPMI عن طريق استكمال RPMI بمصل الأبقار الجنينية بنسبة 3٪ فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) سيجما ألدريتش ص 8139 مصل الأبقار الجنينية (FBS) Wisent 080-150 طبق زراعة أنسجة متكامل بشبكة 20 مم (150 × 25 مم) صقر 353025