تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. استعد مسبقا
- تحضير الوسائط الكاملة: RPMI مكمل ب 2 ملي مولار من الجلوتامين ، و 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 10٪ FBS.
- تحضير وسائط DNase: 50 مل من وسائط RPMI مكملة ب 7.5 ميكروغرام DNase (اصنعها طازجة ، واحتفظ بها على الثلج في جميع الأوقات).
- تحضير وسائط الكولاجيناز-DNase: 5 مل من وسائط DNase بالإضافة إلى 3.2 مجم / مل من الكولاجيناز من النوع الرابع (اصنعها طازجة ، واتركها على الثلج في جميع الأوقات).
- جهاز طرد مركزي مسبق التبريد إلى 4 درجات مئوية.
- حاضنة شاكر دافئة إلى 37 درجة مئوية.
2. العزل والتشريح وعزل الخلايا من كتل اللثة
- قتل الفئران عن طريق تعريضها لثاني أكسيد الكربون2 في غرفة مناسبة ، وفقا لإرشادات اللجنة الاستشارية لأبحاث (ARAC).
- افتح تجويف الصدر والبطن لكشف القلب والأعضاء الداخلية. للانفجار ، قم بعمل شق في الوريد الأجوف السفلي وقم ببث 3 مل من PBS عبر البطين الأيسر باستخدام حقنة 3 مل بإبرة 27 جرام.
- شل حركة جسم الفأر ورأسه على وسادة بحيث تكون المعدة متجهة لأعلى.
- قم بقص كل شفة باتجاه الرقبة بالمقص ، وفصل الجلد الذي يغطي منطقة الفك السفلي والرقبة ، وتعريض الأنسجة والعضلات الأساسية. تشريح الشفة السفلية للكشف عن الفك السفلي.
- قطع بين القواطع السفلية لفصل جانبي الفك السفلي وشل حركة كل جانب للوصول إلى تجويف الفم.
- تصور وتشريح الحنك بعيدا عن تجويف الأنف.
- قم بتشريح المناطق باستخدام 10 شفرات وقم بتضمين مناطق الضرس الفكي العلوي والفك السفلي مع اللثة المحيطة (الشكل 1). قم بعمل شقوق رأسية أمام الضرس الأول والخلفي للضرس الثالث وشق أفقي عند حدود اللثة (ياقات بيضاء من الأنسجة المحيطة بالأسنان).
- ضع كتل الفك العلوي والفك السفلي في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع 5 مل من الكولاجيناز / DNase (استمر في وضع الثلج).
- احتضن في حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة وخلال آخر 5 دقائق من الحضانة أضف 50 ميكرولتر من 0.5 M EDTA.
- أضف 5 مل من وسائط DNase الباردة إلى الأنبوب سعة 50 مل مع المناديل الورقية ولفها برفق للخلط.
- انقل 4 كتل من الأنسجة إلى طبق بتري وقم بتغطيتها ب 500 ميكرولتر من وسائط DNase. قم بإزالة اللثة من كل كتلة من الأنسجة باستخدام شفرة مشرط وتوجيه الشفرة إلى مناطق اللثة وبين الأسنان.
- انقل الأنسجة والوسائط من طبق بتري بالإضافة إلى وسائط DNase السابقة المستخدمة أثناء التشريح إلى أنبوب جديد سعة 50 مل عبر مصفاة الخلية (حجم 70 ميكرومتر). اغسل بوسائط DNase (3-5 مل) جميع الأدوات المستخدمة وقم بالتصفية.
- باستخدام مكبس حقنة معقمة سعة 3 مل ، اهرسي الأنسجة على المصفاة ، وقم بالترشيح باستخدام وسائط DNase الباردة (30 إلى 35 مل).
- اغسل مصفاة الخلية بوسائط DNase الباردة.
- جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية ، 314 × جم لمدة 6 دقائق.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليقها في 1 مل من الوسائط الكاملة.
- عد الخلايا (يجب أن تتراوح الكمية المتوقعة بين 8 × 105 إلى 1.2 × 106 خلايا مع قابلية صلاحية >80٪) باستخدام عداد خلوي آلي.
