$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. عينات أنسجة الرئة
ملاحظة: بالنسبة للدراسات في الجسم الحي لأنسجة الرئة ، ادرس العينات بعد التعرض ذي الصلة. التعرض الأكثر صلة بهذه التجربة هو الكائنات الحية الدقيقة المعدية ، وخاصة البكتيريا. سلالات الفئران التي يمكن استخدامها لهذه الطريقة هي الفئران C57BL / 6 أو BALB / c ، التي تتراوح أعمارها بين 10 و 12 أسبوعا ، والوزن 25-30 جم ، والذكور.
- القتل الرحيم للفئران عن طريق حقن داخل الصفاق من الكيتامين (400 ملغم/كغ) والزيلازين (40 ملغم/كغ). افتح التجويف الصدري وفضح الرئتين والقلب باستخدام ملقط جراحي ومقص.
- قم بغرس PBS الدافئ باستخدام إبرة قياس 21 في البطين الأيمن لغسل الدم من الأوعية الدموية لمدة 30 ثانية ، ثم قم بنقع 10 مل من مثبت PLP 2٪ لمدة 30 ثانية (في البطين الأيمن).
- استخدم PBS دافئا (42 درجة مئوية) لغسل تجويف الصدر المفتوح. قم بتنبيب القصبة الهوائية بإبرة قياس 21 وقطعة من أنبوب 0.8 مم مقطوعة حسب الحجم ، وحقن 800 ميكرولتر من محلول الاغاروز الدافئ مسبقا (حتى 42 درجة مئوية) ونقطة انصهار منخفضة 3٪.
- اربط القصبة الهوائية بالحرير المضفر (4.0 USP). ضع الخيط حول القصبة الهوائية ، أسفل نقطة إدخال القنية مباشرة ، وثبته عبر عقدة علوية بسيطة. لترسيخ الاغاروز ، قم بإدارة PBS المثلج حول الرئتين. قم بإزالة الرئتين والقلب ككتلة من التجويف الصدري باستخدام كل من المقص والتشريح الحاد. قم بإزالة كل رئة على حدة ثم قم بإصلاحها لمدة 16 ساعة في 2٪ PLP أو الفورمالين عند 4 درجات مئوية.
- قم بتخزين العينات في PBS عند 4 درجات مئوية حتى تقسيم الأنسجة.
- لتحضير عينات أنسجة الرئة ، استخدم الخطوات التالية.
- قم بإصلاح أنسجة الرئة (مقطوعة في الخطوة 1.1) في الفورمالين الطبيعي 10٪ لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. انقله إلى 75٪ من الإيثانول وضعه في معالج المناديل في دورة مدتها 12 ساعة ، (2.5 ساعة في 75٪ EtOH ، 3 ساعات في EtOH المطلق ، 3.5 ساعة في المذيب 3B ، و 3 ساعات في البارافين).
- قم بتضمينها في البارافين القياسي لإنشاء كتل مثبتة بالفورمالين ومدمجة في البارافين (FFPE) يتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظه: في هذه المرحلة ، من الملائم بشكل عام قطع أقسام الرئة للشرائح القياسية.
- قم بقص أقسام الرئة FFPE بسمك 4-5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم وقم بتثبيتها على شرائح مشحونة ومغلفة.
- لتركيب الشرائح، ضع 3 قطرات من وسيط التركيب على أغطية مقاس 60 مم × 24 مم (الحجم 1.5)، واقلب الشريحة على شريحة الغطاء، وادفع الوسط الزائد للخارج. قم بإغلاقها بإحكام بطلاء الأظافر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
< p class = "jove_title" >
2. تحضير / فحص مجهري لعينات أنسجة الرئة
- لإزالة الشمع ، قم بإعادة ترطيب عينة أنسجة الرئة FFPE ومعالجتها مسبقا بمحلول استرجاع المستضد.
- جفف شرائح FFPE في الفرن لمدة 60 دقيقة عند 60 درجة مئوية. ثم ضع الشرائح في محلول الزيلين لمدة 30 دقيقة وانقلها إلى محلول الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اشطفه بماء الصنبور.
- ضعها في غلاف بلاستيكي مقاوم للحرارة وتخضع لاسترجاع مستضد HIER في قدر الضغط لمدة 10 دقائق في 10 م / مول / لتر تريس ، 1 مليمول / EDTA درجة الحموضة 9.0. تبرد لمدة 20 دقيقة. اغسل مرتين في ماء الصنبور لمدة 5 دقائق على الروك ، ثم مرة واحدة باستخدام PBS على الروك.
- كتلة مع 10٪ مصل دجاج في 5٪ BSA / PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- وصمة عار الأنسجة.
- لتحديد METs في البلاعم ، أضف الأجسام المضادة الأولية (MMP-9 و H3Cit و F4 / 80) في 1٪ BSA / PBS لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية عند تخفيف 1/100 (يتم سرد تفاصيل محددة حول كميات الأجسام المضادة في جدول المواد). اغسل مرتين باستخدام PBS لمدة 5 دقائق على هزاز.
- تحقيق الكشف عن الفلورسنت عن طريق الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة في 1٪ BSA / PBS لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الأجسام المضادة هي: (1) دجاج مضاد للفأر 488 (أخضر) ، (2) دجاج مضاد للماعز 594 (أحمر) ، و (3) حمار مضاد للفأر 647 (أحمر بعيد).
- اغسل الأقسام في PBS وقم بتثبيتها بوسيط تثبيت يحتوي على DAPI لتلوين الكروماتين.
- احصل على صور الفلورسنت باستخدام رأس مسح ليزر متحد البؤر متصل بمجهر مقلوب.
- قم بإثارة التحضير باستخدام ليزر 405 و 488 و 561 و 647 نانومتر. التقط صورا أحادية المستوى بدقة 512 × 512 بكسل من خلال النقر على زر التسوية المتسلسل للخط (متوسط سطرين) باستخدام أهداف 20X 0.1 NA air و 40X 1.0 NA oil.
- احصل على ما لا يقل عن عشرة حقول رؤية لكل قسم للتحليل والبيانات لكل نتيجة (على سبيل المثال ، 10 مجالات رؤية عالية الطاقة (HFOV) للتحكم ، و 10 للعينة المحفزة ، وما إلى ذلك ، لكل ماوس).
ملاحظه: للحصول على عينة تمثيلية للحقل بأكمله ، يمكن استخدام نظام مصفوفة يتم فيه تقسيم الحقل إلى أقسام مختلفة ، ولكل عينة مختلفة يتم استخدام نفس المصفوفة لتحديد مجالات الرؤية (على سبيل المثال ، يمكن تقسيم الحقل إلى 9 أقسام ، ومن المركز والزوايا الأربعة ، يتم أخذ اثنين من HFOV).