مقالة منهجية

تحضير مستحلب مساعد للمستضد للحث على التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Bäckström ، B. T. طريقة تجانس سريعة وبسيطة وموحدة لإعداد مستضدات / مستحلبات مساعدة لإحداث التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو تقنية تجانس فعالة لتوليد مستحلب مساعد مستضد للحث على التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) في نموذج الفئران. يحتوي المستحلب على مستضد ذاتي - بروتين سكري قليل التغصن المايلين (MOG) - في الطور المائي ، محاطا بمرحلة زيت مستمرة تشتمل على بكتيريا مسببة للأمراض معطلة يضمن المستحلب إطلاقا مستداما للمستضدات لاستجابة مناعية طويلة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

ملاحظة: تم وصف التدفق التخطيطي للطريقة في الشكل 1.

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير المواد

ملاحظة: قم بإعداد جميع الكواشف بشكل معقم في غطاء معقم ، وقم بتخزينها في درجة الحرارة المحددة. يمكن تخزين الكواشف لمدة تصل إلى 2 سنوات دون أن تفقد تأثيرها.

  1. تحضير CFA المحتوي على 20 ملغ/مل متفطرة السل كما هو موضح أدناه.
    1. أضف 100 مجم من M. tuberculosis H37RA المجفف بالتجميد (انظر جدول المواد) وخمس حبات فولاذية مقاس 3.2 مم إلى أنبوب سعة 7 مل (انظر جدول المواد). هز الأنبوب في الخالط (انظر جدول المواد) لمدة 60 ثانية بأعلى إعداد للسرعة (5,000 دورة في الدقيقة).
    2. أضف 5 مل من مساعد فرويند غير المكتمل (IFA) إلى الأنبوب ورجه مرة أخرى لمدة 60 ثانية بأعلى سرعة. انقل ملاط السل المتجانس في IFA (المسمى الآن CFA) إلى أنبوب جديد بماصة ، مع ترك الخرز وراءه ، وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. أضف الماء عالي النقاء إلى المسحوق المجفف بالتجميد من الببتيدMOG 35-55 (انظر جدول المواد) للحصول على تركيز الببتيد النهائي البالغ 10 مجم / مل. عقم المحلول عن طريق تمريره عبر مرشح 0.2 ميكرومتر. تحضير 60 ميكرولتر من الحصص وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظه: الببتيد MOG35-55 المستخدم في هذه التجربة ذو نقاء ImmunoGrade (~ 70٪) ، وهو مشقوق TFA ، ويذوب بسهولة في الماء ، ويحتوي على أميد C-terminal (-NH2) لزيادة الاستقرار في الجسم الحي. لم يتم إذابة كميات الببتيد وإعادة تجميدها أكثر من مرتين ، وتم تخزينها عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
فئة

2. تحضير مستحلبات CFA / الببتيد

  1. احسب كمية المستحلب اللازمة للتحصين. في هذا البروتوكول القياسي ، يتلقى كل فأر 50 ميكروغرام من الببتيد MOG35-55 و 300 ميكروغرام من M. السل المشتت في مساعد فرويند (CFA). يمكن حساب كمية كل كاشف (MOG35-55 الببتيد ، PBS ، CFA ، و IFA) المطلوبة لتحضير المستحلبات باستخدام الملف التكميلي 1. يتم تضمين 20٪ إضافية من جميع الكواشف ، للتعويض عن الفقد الطفيف للمستحلب ، في الحساب.
    ملاحظه: تتكون مجموعة المستحلب التجارية (انظر جدول المواد) المستخدمة في هذه الدراسة من أنبوب وغطاء لولبي ومكبس في كيس معقم. يحتوي كل أنبوب من مجموعة المستحلب على 9.6 مل كحد أقصى ، مما يجعل من الممكن تحضير محاقن 8 × 1 مل كافية لتحصين 40 فأرا (أو 80 فأرا في حالة استخدام 100 ميكرولتر من المستحلب لكل).
  2. ضع الأنبوب المغطى بالمسمار (من مجموعة المستحلب التجارية) والكواشف لاستخدامها على الثلج.
  3. أضف مكونات المستحلب بالترتيب التالي بالأحجام المحسوبة في الخطوة 2.1: PBS ، ثم الببتيد ، ثم M. السل في CFA ، وأخيرا IFA.
  4. أغلق الأنبوب بالغطاء بإحكام عن طريق إحكام ربطه وفكه عدة مرات. رج الأنبوب بقوة لمدة 5-10 ثوان يدويا لخلط الكواشف مسبقا.
  5. ضع الأنبوب في الخالط المهتز وثبته بالقضيب. اضبط السرعة على أعلى إعداد والوقت على 60 ثانية. بمجرد الانتهاء من الجري ، ضع الأنبوب على الثلج لمدة 3 دقائق. كرر التشغيل مرة أو مرتين أخريين بنفس الإعدادات.
    6. قم
  6. بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 × جم لمدة 1 دقيقة لإزالة الهواء المحبوس وضغط المستحلب.
  7. قم بإزالة الغطاء من الأنبوب ، وأدخل المكبس في الأنبوب ، وادفعه لأسفل ببطء حتى يصل إلى الجزء العلوي من المستحلب. قم بإزالة الإغلاق الإضافي الموجود أسفل الأنبوب عن طريق لفه.
  8. قم بإزالة المكبس من حقنة الحقن (1 مل ؛ انظر جدول المواد). أضف إبرة (يفضل 25-27 جم) إلى حقنة الحقن.
  9. قم بتوصيل الطرف الخلفي من حقنة الحقن بالقفل المخصص في الجزء السفلي من الأنبوب وقفله بلف قصير.
  10. انقل المستحلب من الأنبوب إلى حقنة الحقن عن طريق دفع المكبس برفق. توقف عندما يصل المستحلب إلى 0.15 مل من تدرج حقنة الحقن.
  11. افصل حقنة الحقن عن الأنبوب وأدخل المكبس بعناية ، مع الحرص على عدم دخول الهواء إلى المحقنة. ادفع المكبس حتى يخرج المستحلب من الإبرة.
    ملاحظه: في هذه المرحلة ، يمكن استخدام بعض المستحلب لمراقبة الجودة (انظر الخطوة 3).
  12. كرر الخطوات 2.8-2.11 لبقية المستحلب الموجود في الأنبوب.
    ملاحظه: لتقليل إهدار مستحلبات CFA / مستضد باهظة الثمن ، يجب استخدام محاقن 1 مل. يمكن استخدام محاقن أخرى تناسب القفل المخصص في الجزء السفلي من الأنبوب. ومع ذلك ، قد يلزم تحضير كمية أكبر من المستحلب. يمكن تخزين مستحلب الببتيد CFA /MOG 35-55 عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 15 أسبوعا دون أن يفقد قدرته على تحفيز EAE.
فئة

3. مراقبة جودة المستحلب

  1. اختبار السقوط: أضف قطرة صغيرة من المستحلب إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل مملوء ب 20 مل من الماء البارد. أغلق الأنبوب ورجه يدويا لبضع ثوان. يؤكد ظهور قطرات صغيرة مميزة تكوين مستحلب الماء في الزيت.
  2. افحص المستحلب باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور.
    1. لتحليل حجم جزيئات الماء في الزيت ، أضف قطرة صغيرة (2-3 ميكرولتر) من المستحلب إلى شريحة المجهر ، وقم بتشويهها بقلة غطاء ، ثم ادفع بقوة في حركة دائرية لتسطيح المستحلب.
    2. افحص المستحلب الملطخ تحت مجهر تباين الطور (انظر جدول المواد) بتكبير 400x وركز على حقل به طبقة أحادية من المستحلب. تأكد من ظهور جزيئات صغيرة موحدة رمادية / بيضاء (الشكل 2 أ).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: تخطيطي لعملية تحضير المستحلب باستخدام مجموعة مستحلب تجارية. أعيد استخدام هذا الرقم من Topping et al بإذن.

< p class = "jove_content" >figure-results-2
الشكل 2: توصيف المستحلبات المنتجة باستخدام طرق مختلفة. (أ) صور تمثيلية من ثلاث طرق تحضير مختلفة: طريقة التجانس القياسية ، وطريقة الحقنة التقليدية ، وطريقة الدوامة. تم وضع كمية صغ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1 مل حقنة حقن ب. براون 9166017 فولت 1 مل حقنة حقن سيجما ألدريتش Z683531 7 مل أنابيب فارغة مع أغطية بيرتين إنسترومنتس P000944LYSK0A.0 أنبوب 7 مل 50 مل أنبوب الطرد المركزي المعقم فيشر ساينتيك 10788561 أنبوب 50 مل مشتت ، زيت معدني خفيف سيجما ألدريتش م 8410 تخزين في RT طقم مستحلب بيرتين إنسترومنتس D34200.10 ح. تحتوي على أنبوب وغطاء ومكبس مساعد فرويند غير مكتمل سيجما ألدريتش F5506 يحفظ في +4 درجة مئوية المتفطرة السلية ، H37RA فيشر ساينتيك DF3114-33-8 يحفظ في +4 درجة مئوية الخالط الشخصي Minilys بيرتين إنسترومنتس P000673-MLYS0-A اهتزاز الخالط MOG 35-55 الببتيد إننوفاجين غير متاح مونتانيد ISA 51 VG سببيك 36362Z مساعد الزيت المعتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) مرشحات حقنة Pall Acrodisc 0.2 ميكرومتر فيشر ساينتيك 17124381 مرشح معقم برنامج تلفزيوني ، Ca2 + / Mg2 + مجانا ثيرمو فيشر العلمي 14190144 برنامج تلفزيوني مجهر تباين الطور أوليمبوس BX40-B حبات فولاذية 3.2 مم فيشر ساينتيك NC0445832 الأوتوكلاف والتخزين في RT

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CFA IFA

مقالات ذات صلة