تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. تحضير الماوس
ملاحظة: سيستغرق الإجراء التالي ، بما في ذلك تحضير والجراحة ، من 30 إلى 40 دقيقة. قبل الجراحة ، قم بتشغيل المجهر وقم بتسخين الحاضنة المغلقة على المجهر إلى 37 درجة مئوية.
- قم بإجراء تجارب على فئران TcrdEGFP التي يبلغ عمرها من 8 إلى 10 أسابيع على خلفية C57BL / 6 ، والتي تم الحصول عليها من برنارد ماليسن (INSERM ، باريس ، فرنسا). وفقا للإجراء المعتمد من IACUC ، قم بتخدير الفأر عن طريق حقن الكيتامين (120 مجم / كغ) والزيلازين (10 مجم / كجم) بناء على وزن. تقييم مستوى التخدير عن طريق معدل التنفس (55-65 نفسا في الدقيقة) ، وقرص إصبع القدم ، وانعكاسية الجفن.
- بمجرد الوصول إلى التخدير الجراحي ، قم بتأمين الأرجل الخلفية للفأر باستخدام شريط لاصق في وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم ، والتي يمكن مراقبتها بواسطة مقياس حرارة المستقيم. إذا كانت هناك علامات على أن التخدير آخذ في التلاشي (على سبيل المثال ، زيادة معدل التنفس ، والوميض و / أو استجابة ارتعاش عضلات العين لمنعكس الجفن) ، فأعد إعطاء 50 ميكرولتر من الكيتامين / الزيلازين في المرة الواحدة حتى يتم تخدير الفأر بالكامل.
- تحضير الصبغة النووية عن طريق تخفيف 50 ميكرولتر من Hoechst 33342 (10 مجم / مل) مع 315 ميكرولتر من 0.9٪ محلول ملحي ؛ التركيز النهائي هو 37.5 مجم / كجم بناء على وزن الفأر (حجم تقريبي 200 ميكرولتر). بمجرد تخدير الفأر ، قم بحقن Hoechst ببطء باستخدام حقنة السل من خلال الجيوب الأنفية الوريدية المدارية الرجعية.
ملاحظة: انتظر 1-2 دقيقة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية للسماح للفأر بالتأقلم مع التغير في حجم الدورة الدموية بعد الحقن المداري الرجعي.
- ضعي كمية صغيرة من مواد التشحيم على العينين لمنعهما من الجفاف.
2. جراحة الفأر: شق البطن لفضح الغشاء المخاطي للأمعاء
- قم بعمل شق عمودي بطول 2 سم عبر الجلد والصفاق على طول خط الوسط لأسفل البطن لإخراج منطقة الأمعاء المراد تصويرها.
- باستخدام ملقط بزاوية ، اسحب الأعور بعناية من التجويف البريتوني وحدد منطقة الأمعاء الدقيقة المراد تصويرها. احرص على عدم تمزق الأوعية الدموية المساريقية أثناء هذه العملية. لتقليل الضرر أو النزيف المحتمل ، تجنب الإمساك بالأمعاء أو قرصها بالملقط.
- حدد موقع مناسب من الأمعاء الدقيقة (2-3 سم) للتصوير الذي يحتوي على الحد الأدنى من محتويات البراز. أعد الأعور والأمعاء الدقيقة المتبقية بعناية إلى التجويف البريتوني ، مع ترك الجزء محل الاهتمام خارجيا.
ملاحظة: تجنب ثقب الأعور أو تعطيل الأوعية الدموية المساريقية خلال هذه الخطوة.
- ضع زوجين من الملقط على جانبي المساريق الأساسي بين الأوعية الدموية ، وافرك أطراف الملقط معا برفق لإحداث ثقب في الغشاء (الشكل 1). سيسمح ذلك للإبرة بالمرور عبر المساريق عند إغلاق التجويف البريتوني تحت الأمعاء.
- أغلق الشق مع الحفاظ على حلقة الأمعاء خارجية. باستخدام ملقط بزاوية وإبرة منحنية مستدقة متصلة بخياطة 5 سم ، اخترق جانبا واحدا من الصفاق ، واذهب عبر الفتحة التي تم إجراؤها في الخطوة السابقة ، وصعودا عبر الجانب الآخر من البطانة البريتونية. ضع خياطة واحدة في الأعلى وأخرى بالقرب من الجزء السفلي من الشق. < / >
ملاحظة: تجنب إتلاف الأوعية الدموية خلال هذه الخطوة.
- كرر هذه العملية لإغلاق الجلد تحت الحلقة المعوية ، عن طريق وضع خياطة واحدة في منتصف الشق ، بين الغرز السابقة في الصفاق الأساسي.
ملاحظة: من المهم فقط إخراج المنطقة المراد تصويرها. سيؤدي ذلك إلى تقليل الحركة الدخيلة أثناء التصوير. تأكد من تجنب ربط الشرايين المساريقية.
- استخدم الكي الكهربائي لعمل خط ثقب على طول الحدود المضادة للمساريقية. مباشرة بعد الكي ، ضع بضع قطرات من الماء على سطح الأمعاء لمنع تلف الأنسجة الإضافي الناجم عن الحرارة. امسح ب Kimwipe لإزالة الماء المتبقي.
- قم بقص شق أفقي صغير عند الحافة البعيدة للأنسجة المكوية باستخدام مقص Vannas واستمر في القطع على طول الخط المقوي باتجاه الطرف القريب من جزء الأنسجة الخارجية (حوالي 1.5 سم في الطول) لفضح سطح الغشاء المخاطي. < / >
ملاحظة: إذا لزم الأمر ، استخدم الملقط لإزالة أي محتوى براز زائد متبقي على سطح الغشاء المخاطي المكشوف.
- قم بتغطية بطن الفأر ب Kimwipe رطب لمنع الجفاف من الأنسجة. انقل الماوس إلى المجهر في وعاء مغطى.
فئة
3. الحصول على الصور عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر للقرص الدوار
- ماصة 150 ميكرولتر من 1 ميكرومتر AlexaFluor 633 في HBSS على الغطاء الزجاجي أسفل طبق 35 مم. ضع الماوس بحيث يلامس السطح المخاطي المفتوح الغطاء مباشرة.
- قم بإمالة رأس المجهر للخلف وضع الماوس على الطبق المنزلق في مرحلة التصوير في حاضنة مدفأة مسبقا. بدلا من ذلك ، قم بتغطية الماوس ببطانية تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم.
- قم بتشغيل برنامج التصوير. يجب ألا تتجاوز شدة الإثارة ووقت التعرض لكل ليزر 10-15 ميجاوات أو 120-150 مللي ثانية ، على التوالي ، لتجنب التبييض الضوئي وتقليل الفاصل الزمني بين النقاط الزمنية. اضبط متوسط الإطار على "2" وقم بتشغيل وظيفة كسب EM لتقليل ضوضاء الخلفية. حدد معايرة موضوعية 63x لضمان القياس الصحيح لحجم البكسل.
ملاحظة: تهدف الإعدادات المفصلة أعلاه إلى توفير مرجع أولي ، ولكنها ستختلف اعتمادا على تكوينات المجهر الفردية.
- باستخدام ليزر 405 نانومتر والهدف الجوي 20x ، تصور النوى لتحديد مجال الزغابات الذي يفتقر إلى الحركة الملحوظة أو الانجراف بالعين. تجنب مناطق الحركة الاصطناعية بسبب التنفس أو التمعج أو ضربات القلب.
- باستخدام مسح XY ، سجل إحداثيات XY لمجال الاهتمام وانتقل إلى هدف غمر الجلسرين 63X.
- تأكد من أن الزغابات في الحقل المحدد مستقرة من خلال الحصول على صورة حية على قناة 405 نانومتر لمدة تصل إلى 1 دقيقة.
- أثناء الحصول على صورة حية على قناة 405 نانومتر ، اضبط التركيز للعثور على المستوى المتعامد أسفل الطرف الزغبي مباشرة. احصل على مداخن Z بدءا من أسفل ظهارة الطرف الزغابي مباشرة أسفل الزغابات حتى يصعب حل النوى ، حوالي 15-20 ميكرومتر ، باستخدام خطوة 1.5 ميكرومتر. < / >
ملاحظة: عند التصوير بثلاث قنوات (405 ، 488 ، 640 نانومتر) باستخدام أوقات التعريض الموصوفة أعلاه ، من الممكن الحصول على جميع القنوات الثلاث بالتتابع على فترات 20 ثانية تقريبا.
- افتح البرنامج في وضع التحليل ، بعد 3-5 دقائق من بدء الاستحواذ ، لتأكيد استقرار الصورة وحركية γδ IEL. استمر في الحصول على الصور لمدة 30-60 دقيقة لكل حقل من الزغابات. سجل 2-3 حقول لكل ماوس. أثناء التصوير ، راقب الماوس كل 5 دقائق.
