$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. إنتاج وتوصيف LMPs
ملاحظة: لمنع التلوث ، تأكد من أن جميع المواد المستخدمة في هذه التجربة معقمة أو معقمة. قم بتنفيذ جميع الخطوات في RT في خزانة السلامة البيولوجية في ظل ظروف معقمة ، ما لم يذكر خلاف ذلك.
- تحفيز وجمع النواب
- قم بإذابة كمية من 10 ملايين خلية CEM T في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. خفف في 10 مل وسط مكونة للدم خال من المصل مسخن مسبقا مثل X-VIVO ، في أنبوب معقم سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي بوزن 200 جم × 5 دقائق. شفط المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في وسط 5 مل دافئ مسبقا.
- انقل الخلايا إلى قارورة زراعة الأنسجة T75 (للخلايا المعلقة) مع 15 مل وسط مكونة للدم مسخن مسبقا مثل X-VIVO واحتضانها لمدة 4 أيام في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
- بعد 4 أيام ، انقل جميع وسط المزرعة والخلايا إلى قارورة ثقافة الأنسجة T175 التي تحتوي على 100 مل من الوسط الطازج. استمر في احتضان الخلايا لمدة 72 ساعة تقريبا في نفس الظروف حتى تنمو إلى كثافة 2 مليون خلية / مل.
- قم بتقسيم الخلايا بالتساوي بين أربع قوارير T175 تحتوي كل منها على 150 مل من الوسط الطازج واستمر في زراعة الخلايا حتى تنمو الخلايا (حوالي 48 ساعة من الحضانة) إلى كثافة 2 مليون / مل.
- اجمع الخلايا من كل قارورة عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق وأعد تعليق 300 × 106 خلايا في قارورة T175 جديدة تحتوي على 150 مل وسط طازج ، للحفاظ على كثافة الخلايا 2 مليون / مل.
- يضاف الأكتينومايسين D (المذاب في DMSO بمعدل 2 مجم / مل) إلى الوسط بتركيز نهائي قدره 0.5 ميكروغرام / مل ويحتضن لمدة 24 ساعة.
- انقل كل وسط المزرعة إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل وقم بتدوير الخلايا عند 750 × جم لمدة 5 دقائق. انقل المادة الطافية إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل وأجهزة طرد مركزي بحجم 1,500 × جم لمدة 15 دقيقة لإزالة شظايا الخلايا الكبيرة.
- انقل المادة الطافية إلى زجاجة سعة 250 مل وجهاز طرد مركزي فائق بحجم 12,000 × جم لمدة 50 دقيقة.
- اغسل الكريات المخصبة ب LMPs ب 40 مل PBS معقم في أنبوب سعة 50 مل عن طريق الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة 50 دقيقة.
- اجمع آخر مادة طافية للغسيل ؛ سيتم استخدامها كتحكم في السيارة. قم بتعليق كريات LMP في 1 مل من PBS وانقلها إلى أنبوب دقيق معقم سعة 1.5 مل. قم بتخزين LMPs المعزولة عند -80 درجة مئوية (لتجنب دورات الذوبان الحرة المتعددة).