$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. إثراء خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد بالخلايا العارضة للمستضد الاصطناعي للجسيمات النانوية المحضرة.
- عزل الخلايا التائية CD8 +.
- قتل عن طريق التعرض للإيزوفلوران متبوعا بخلع عنق الرحم.
- قم بإزالة الطحال والغدد الليمفاوية من الفئران البرية C57BL / 6j وضعها في محلول PBS. نقع الأعضاء والتخلص من الخلايا من خلال مصفاة خلوية معقمة 70 ميكرومتر مع غسلات متكررة من PBS.
- للتخلص من الخلايا التائية غير CD8 + ، استخدم مجموعة عزل الخلايا التائية CD8 + التي لا تعمل باللمس واتبع تعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظة: تتطلب كل حالة مستضد ما لا يقل عن 3 × 106 خلايا CD8 + T.
- أضف الجسيمات النانوية aAPCs للارتباط بخلايا CD8 + T.
- بعد العزل ، التركيز على حجم 100 ميكرولتر في PBS مع 0.5٪ ألبومين مصل بقري (BSA) و 2 ملي مولار EDTA.
- حدد عدد aAPCs المراد إضافتها عن طريق الحساب بناء على نسبة 1011 معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC-Ig) المرتبط ب aAPC والمحمل بالببتيد لكل 106 خلايا CD8 + T.
- احتضان جزيئات aAPC وخلايا CD8 + T لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية مع الخلط المستمر في أنبوب معقم من البوليسترين مستدير سعة 5 مل.
- تحضير الوسائط المكملة وعامل نمو الخلايا التائية (TCGF) لتصفية وزراعة خلايا CD8 + T.
- بالنسبة للوسائط المكملة ، استكمل وسائط RPMI 1640 الكاملة (مع الجلوتامين) ب 1x أحماض أمينية غير أساسية ، 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، محلول فيتامين 0.4x ، 92 ميكرومتر 2-ميركابتو إيثانول ، 10 ميكرومولار سيبروفلوكساسين و 10٪ مصل بقري جنين (FBS).
- لعمل TCGF ، اتبع البروتوكولات المعمول بها.
ملاحظه: TCGF عبارة عن مزيج داخلي من السيتوكينات المناعية البشرية وهو أمر ضروري لتزويد الخلايا التائية بإشارات تحفيز إضافية اللازمة للنمو. يمكن استبدال TCGF بالسيتوكينات المنبهة للخلايا التائية المعروفة مثل IL-2 أو IL-7 أو IL-15. ومع ذلك ، قد يستقطب كل منها استجابة الخلية التائية وفقا لذلك.
- اغسل واخصي خليط الخلايا التائية aAPC و CD8 +.
- اغسل الجسيمات المغناطيسية aAPCs ، أولا باستخدام المخزن المؤقت PBS مع 0.5٪ BSA و 2 mM EDTA ، وثانيا باستخدام الوسائط المكملة ، والثالث باستخدام الوسائط المكملة بنسبة 1٪ TCGF.
- aAPCs المزخرفة وخلايا CD8 + T المخصبة في 500 ميكرولتر من الوسائط المكملة بنسبة 1٪ TCGF.
- عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم وصفيحة في صفيحة 96 U ذات قاع U في 160 ميكرولتر لكل بئر من الوسائط المكملة ب 1٪ TCGF بتركيز 2.5 × 105 خلايا CD8 + T / مل.
- في حالة العزل باستخدام aAPCs مع معقد التوافق النسيجي الكبير المحمل بالببتيد فقط على السطح (لا توجد إشارات تحفيز مشترك) ، أكمل الخطوة 4.5. في حالة العزل باستخدام aAPCs مع كل من MHC-Ig المحمل بالببتيد على السطح وإشارات التحفيز المشترك ، فانتقل إلى الخطوة 5.
- أضف الجسيمات المغناطيسية المغلفة بإشارات التحفيز المشترك على السطح إلى الجزء المخصب وأضف مجالا مغناطيسيا لتجميع الإشارات التحفيزية على سطح الخلايا التائية.
- إلى الكسور المخصبة ، أضف جسما مضادا محفزا (أو أكبر اعتمادا على قسم التطبيق - انظر حول خصائص aAPC للتحكم) إلى عدد معقد التوافق النسيجي الكبير - Ig المحمل بالببتيد على الجسيم.
- اسمح للجزيئات المغناطيسية المحفزة المشتركة بالارتباط بخلايا CD8 + T المخصبة لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
- أضف مجالا مغناطيسيا عن طريق وضع لوحة الثقافة بين مغناطيسي قرص نيوديميوم N52 بطول 1.9 سم (0.75 بوصة><).
ملاحظه: مغناطيس القرص N52 له مجال قوي للغاية. يجب توخي الحذر لتخزينها بفواصل بين المغناطيس ، حيث يصعب إزالتها من بعضها البعض عند وضعها على ألواح الثقافة. لتقليل المغناطيس من الالتصاق بالمكونات المعدنية للحاضنة ، ضعه في حاويات الستايروفوم المخروطية سعة 50 مل في كل من الأسفل والأعلى.
2. توسيع واكتشاف خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد باستخدام الخلايا العارضة للمستضد الاصطناعي للجسيمات النانوية المحضرة
- أضف لوحة البئر ذات القاع 96 U مع aAPCs و CD8 + T في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام. في اليوم 3 ، قم بتغذية الخلايا ب 80 ميكرولتر لكل بئر من الوسائط المكملة بنسبة 2٪ TCGF وضعها مرة أخرى في الحاضنة حتى اليوم 7.
- في اليوم 7 ، قم بحصاد الخلايا المحفزة في أنبوب سفلي دائري سعة 5 مل للعد.
- بمجرد حصاد كل المحلول ، قم بتدوير الخلايا المحصودة لإعادة تعليقها في 0.5 مل من PBS مع 0.05٪ أزيد الصوديوم و 2٪ FBS. عد الخلايا القابلة للحياة عن طريق تلطيخ التريبان الأزرق والاعتماد على مقياس كثافة الدم.
- قم بإزالة 50،000-500،000 خلية محسوبة إلى أنبوبين دائريين جديدين سعة 5 مل للتلوين الخاص بالمستضد. سيتم استخدام أنبوب واحد لصبغة الببتيد - معقد التوافق النسيجي الكبير المماثل ، وسيتم استخدام الأنبوب الآخر للبقعة غير المتشابهة لتحديد تلطيخ الخلفية.
- أضف 1 ميكروغرام من معقد التوافق النسيجي الكبير - Ig الحيوي إلى الأنابيب المماثلة وغير المتشابهة في 100 ميكرولتر من PBS مع 0.05٪ أزيد الصوديوم و 2٪ FBS مع الفئران المترافقة الألوفيكوسيانين (APC) CD8a ، استنساخ 53-6.7 (نسبة التخفيف 1: 100) لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
- أضف الستربتافيدين الثانوي وصمة عار ميتة حية. اغسل معقد التوافق النسيجي الكبير الحيوي الزائد باستخدام PBS من خلال الطرد المركزي. ثم قم بتلطيخ جميع العينات بنسبة 1: 350 من الستربتافيدين المسمى ب phycoerythrin (PE) ونسبة 1: 1000 من بقعة الخلايا الخضراء الميتة الحية / الميتة القابلة للإصلاح لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- اقرأ جميع العينات الموجودة على مقياس التدفق الخلوي لتحديد خصوصية وعدد الخلايا الخاصة بالمستضد.
- اغسل البقع الثانوية الزائدة والحية/الميتة عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليقها باستخدام 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS مع أزيد الصوديوم 0.05٪ و FBS 2٪ للقراءة على مقياس التدفق الخلوي.
- تحديد عدد الخلايا الخاصة بالمستضد والنسبة المئوية باستخدام برنامج تحليل البيانات.
- لتحديد النسبة المئوية للخلايا الخاصة بالمستضد ، استخدم البوابات التالية بالترتيب المعني live + و infococitete + (التشتت الأمامي حسب التشتت الجانبي) و CD8 + و Dimer +. حدد بوابة Dimer + من خلال مقارنة غير المتشابهة بالبقعة المتشابهة.
- حدد النسبة المئوية للخلايا الخاصة بالمستضد في العينة عن طريق طرح النسبة المئوية ل Dimer+ من صبغة معقد التوافق النسيجي الكبير - Ig المماثلة من صبغة معقد التوافق النسيجي الكبير - Ig غير المتشابهة.
- باستخدام هذه النسبة المئوية من الخلايا الخاصة بالمستضد ، اضربها في عدد الخلايا التي تم عدها ، مما ينتج عنه عدد الخلايا الخاصة بالمستضد الناتجة عن التخصيب والتوسع.
ملاحظه: يجب إعداد التعويض على مقياس التدفق الخلوي نظرا لوجود تداخل طيفي مع الفلوروفورات المستخدمة في هذه اللوحة.