تقنية لعزل الخلايا البدينة الأولية من تجويف الفئران البريتوني

الملخص

المصدر: Tsvilovskyy, V., et al. عزل الخلايا البدينة المشتقة من الصفاق وتوصيفها الوظيفي باستخدام فحوصات التصوير وإزالة التحلل Ca²+. J. Vis. Exp. (2018).

< p class = "jove_content" >يوضح هذا الفيديو طريقة غسل بريتوني لعزل الخلايا البدينة الناضجة من نوع النسيج الضام من التجويف البريتوني للفئران البالغة. عند عزل خليط من الخلايا المناعية الأولية من التجويف البريتوني ، يتم إجراء التكاثر الانتقائي للخلايا البدينة في ظل ظروف الثقافة المناسبة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. عزل PMC عن طريق الغسيل داخل الصفاق

1. قبل عزل الخلية ، قم بإعداد المواد المدرجة في الجدول 1.
2. استخدم ذكور الفئران التي تتراوح أعمارها بين 8 و 14 أسبوعا لعزل PMC. القتل الرحيم للفأر عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون₂ ، وتأكيد الوفاة بفقدان ردود الفعل. رش الماوس بنسبة 70٪ من الإيثانول وثبته على كتلة رغوية باستخدام دبابيس (الجانب الظهري لأسفل). قم بإزالة الجلد البطني للفأر باستخدام مقص الحواف الحادة. تجنب إتلاف التجويف البريتوني.
   ملاحظه: نستخدم هذا البروتوكول عادة للفئران ذات الخلفية الجينية لسلالة C57BL / 6N.
3. حقن 7 مل من وسط RPMI المثلج و 5 مل من الهواء في التجويف البريتوني باستخدام حقنة سعة 10 مل مزودة بإبرة 27 جرام. ادفع الإبرة بعناية في الصفاق ولا تثقب أي أعضاء. استخدم بقعة في منطقة الدهون البربخية لتقليل خطر انثقاب الأعضاء.
4. بعد الحقن ، هز الماوس لمدة 1 دقيقة لفصل الخلايا البريتونية في وسط RPMI. لا تهز الماوس بقوة لتجنب إتلاف الأعضاء الداخلية وتلويث التجويف البريتوني بالدم.
5. أعد استخدام المحقنة سعة 10 مل عن طريق تجهيزها بقنية جديدة سعة 20 جراما. حرك الأعضاء الداخلية إلى جانب واحد عن طريق إمالة كتلة الرغوة والنقر عليها برفق على المقعد لتسهيل الشفط المتوسط من الجانب الآخر. أدخل إبرة 20 جم ، وشفط السائل من البطن برفق وببطء (~ 0.5 مل / ثانية) لتجنب انسداد الأعضاء الداخلية. اجمع أكبر قدر ممكن من السوائل (عادة 5-6 مل).
6. قم بإزالة الإبرة من المحقنة وانقل تعليق الخلية المجمعة إلى أنبوب تجميع على الجليد. تخلص من أنبوب العينة إذا كان هناك تلوث دم مرئي.
7. الطرد المركزي الأنابيب مع تعليق الخلية عند ~ 300 × جم لمدة 5 دقائق. تحت غطاء معقم شفط طاف. لكل فأر ، امزج عينة الكريات في 4 مل من البارد (4-10 درجات مئوية) PMC Medium وانقل تعليق الخلية إلى قارورة ثقافة 25 سم². أضف عوامل النمو IL-3 و SCF إلى التركيزات النهائية البالغة 10 نانوغرام / مل و 30 نانوغرام / مل ، على التوالي. ضع القارورة التي تحتوي على الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) واحتضنها لمدة ~ 48 ساعة حتى الإجراء التالي.

الجدول 1: المواد الخاصة بالخطوة 1.

1 جليد 2 10 مل محاقن 3 27 جرام إبر 4 20 جرام إبر 5 كتلة ودبابيس الستايروفوم 6 أنابيب التجميع (50 مل أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية) 7 70٪ إيثانول 8 RPMI متوسط (مبرد مسبقا ومحفوظ على الجليد) 9 PMC متوسط: RPMI متوسط + 20٪ FCS (مصل ربلة الساق الجنينية) + محلول ستربتومايسين بنسلين 1٪ (Pen-Strep) 10 محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco - DPBS (بدون Ca²⁺ و Mg²⁺) 11 قوارير الثقافة (25 سم) 12 حلول مخزون عوامل النمو (IL-3: 1 ميكروغرام / ميكرولتر ؛ SCF: 2.5 ميكروغرام / مل) 13 الماصات المصلية (10 مل) 14 أطراف الماصات معقمة (20-200 ميكرولتر) 15 مقياس الدم 16 جهاز الطرد المركزي مقاعد البدلاء 17 مقص وملقط 18 غرفة ثاني أكسيد الكربون₂ للفئران 19 غطاء محرك السيارة المعقم المفتوح 20 غطاء محرك السيارة المعقم المغلق 21 حاضنة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) 22 ماصات النقل (20-200 ميكرولتر)

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات RPMI متوسط الترمو: العلمية 21875034 DPBS سيجما ألدريتش 14190144 FCS الترمو: العلمية R92157 IL-3 أنظمة البحث والتطوير 403 مل SCF الترمو: العلمية PMC2115 بنسترب الترمو: العلمية 15140122 قوارير الثقافة (25 سم) غرينر بيو ون 69160 15 مل أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية سارستيدت 6,25,54,502 جهاز الطرد المركزي مقاعد البدلاء هيريوس ميجافوجي 1.0R