تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.
< p class = "jove_title" >
1. تصنيع الجهاز والطباعة الحجرية الناعمة
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: تم استخدام تقنيات الطباعة الحجرية اللينة القياسية لإنشاء القناة الدقيقة polydimethylsiloxane (PDMS).
- امزج سلائف PDMS بنسبة 10: 1 من القاعدة وعامل المعالجة.
- صب 30 جم من خليط السلائف PDMS في قالب الألمنيوم المصنوع بدقة (انظر الشكل 1 لمعرفة الأبعاد) و 20 جم من خليط السلائف PDMS في طبق بتري 100 مم. < / >
ملاحظه: يستخدم طبق بتري لصنع الفيلم السميك ل PDMS (~ 3 مم) للطبقة الداعمة. توفر الطبقة الداعمة ل PDMS خصائص سطح فيزيائية موحدة في جميع أنحاء الموائع الدقيقة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام فيلم PDMS رفيع على الشريحة الزجاجية. تم تصميم القالب الرئيسي بأبعاد قناة محددة وتصنيعه عن طريق الطحن الدقيق على صفائح الألمنيوم. كانت القناة الحلزونية المستخدمة في هذه الدراسة عبارة عن قناة دقيقة حلزونية من 8 حلقات مع مدخل واحد ومنفذين ، مع زيادة نصف القطر من 8 مم إلى 24 مم للفصل الفعال القائم على الحجم.
- ضع القالب وطبق بتري في مجفف فراغ لتفريغ الغاز حتى لا تظهر فقاعات على السطح ، عادة من 5 إلى 10 دقائق. استخدم مكنسة كهربائية منزلية للمجفف.
- حرر المكنسة الكهربائية وضع القالب وطبق بتري في فرن 90 درجة مئوية لمدة 1 ساعة < / >
ملاحظه: يمكن استخدام لوح تسخين أو أدوات تسخين أخرى بدلا من الفرن.
- أخرجي القالب وطبق بتري من الفرن واتركيه يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- قم بقص المخطط التفصيلي بعناية وقم بثقب فتحات الوصول إلى السوائل على الجهاز باستخدام أداة ثقب 2 مم. < / >
ملاحظه: يمكن أن يختلف حجم الثقب حسب حجم الأنبوب أو دليل السوائل.
- قم بلصق شريط على جانب القناة من الجهاز وفيلم سميك من PDMS ، وقشره بعناية باستخدام ملقط لإزالة الغبار.
- عالج كلا من جانب القناة من الجهاز و PDMS العادي ببلازما الهواء وارتبطها بالطبقة الداعمة المعدة من PDMS العادي (الشكل 1 أ).
- ضع الشريحة على الشريحة الزجاجية مقاس 50 مم × 70 مم وضعها في فرن 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل لتعزيز قوة الترابط.
فئة
2. جمع إفراز القصبة الهوائية من المرضى الذين يخضعون للتهوية الميكانيكية
ملاحظة: يمكن الحصول على إفرازات القصبة الهوائية من المرضى الذين يخضعون للتهوية الميكانيكية أثناء الرعاية الروتينية العادية في مجرى الهواء باستخدام بروتوكول معدل من الطرق التقليدية لاستيعاب المريض القياسي البالغ الذي يخضع لتهوية التهوية. تم إلغاء تحديد العينات وإرسالها على الفور للمعالجة.
- إذا تمت الإشارة إلى شفط القصبة الهوائية، استخدم قسطرة لاستخراج إفرازات مجرى الهواء.
- دفع القسطرة بحذر في منتصف الطريق إلى الأنبوب الرغامي وغرس 5 مل من محلول ملحي عادي معقم بنسبة 0.9٪ من حقنة معبأة مسبقا سعة 10 مل.
- عندما تكون القسطرة متقدمة بالكامل ، أو يتم تلبية المقاومة ، قم بشفط الإفرازات وجمعها في حاوية معقمة لتجميع البلغم.
- اجمع 10 مل من إفرازات القصبة الهوائية في وعاء بلغم معقم وضعه على الثلج. إرسال العينات على الفور للمعالجة.
< p class = "jove_title" >
3. تحضير عينة إفراز القصبة الهوائية
ملاحظة: يجب إجراء جميع التجارب تحت خزانة السلامة البيولوجية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
- قم بتفريق 1 مل من عينات إفراز مجرى الهواء في 9 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) باستخدام حقنة بلاستيكية سعة 10 مل (لتخفيف 10 أضعاف). استخدم ماصة غير حادة لتجانس عينة المخاط.
- قم بتصفية المخفف بمصفاة خلايا نايلون 40 ميكرومتر لإزالة القطع الكبيرة أو الجلطات الدموية ، والتي يمكن أن تسد فتحة الوصول إلى الموائع الدقيقة أو القناة. ضع العينة على الجليد بعد المعالجة.
- قم بتفريق المخفف لكل عينة باستخدام حجم 100x من المخزن المؤقت PBS ، مما ينتج عنه تعليق مخفف 1,000x. ضع العينة على الجليد أثناء عملية التفكك بأكملها.
4. الإعداد التجريبي
ملاحظة: يجب إجراء جميع التجارب تحت خزانة السلامة البيولوجية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
- قم بتجميع شريحة PDMS باستخدام دليل السائل لتطبيق تدفق منتظم على كل قناة من القنوات الدقيقة الحلزونية الأربع (الشكل 1 ب). < / >
ملاحظه: تم استخدام أربع قنوات لزيادة الإنتاجية عن طريق التوازي ، بالإضافة إلى تحسين الحجم وكثافة الخلية للتعليق الناتج. تم تصميم دليل السوائل وتصنيعه باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد من نوع الطباعة الحجرية المجسمة مع راتنج شفاف. يستخدم مدخل ومخرج موجه السوائل موصلات Luer الأنثوية لسهولة الاتصال والختم المستقر أثناء العملية.
- قم بتوصيل موصل Luer ذكر مقاس 1/16 بوصة بالمدخل ومخرج الجدار الداخلي (IW) ومنفذ مخرج الجدار الخارجي (OW) لدليل السوائل وقم بتوصيل أنبوب سيليكون بتعليق العينة.
- أدخل أطراف غير حادة في كل طرف من طرفي المدخل والمنافذ للوصول إلى قاع خزان العينة.
- قم بتوصيل المضخة التمعجية بأنبوب المدخل.
- ضع نهاية أنبوب المدخل وأنبوب مخرج IW في خزان العينة وضع نهاية أنبوب مخرج OW في خزان النفايات (الشكل 1C ، D).
- ضع أنبوب 50 مل من PBS المصفى بدون الكالسيوم والمغنيسيوم في خزان العينة.
- ابدأ الضخ بمعدل تدفق منخفض (~ 1 مل / دقيقة) لتجهيز الجهاز.
ملاحظه: عندما يتم التقاط الفقاعات في القناة ، ادفع الجزء العلوي من القناة باستخدام الملقط لزعزعة استقرار فقاعات الهواء والقضاء عليها. عندما يمتلئ الجهاز بالكامل بمحلول عازل ، قم بتغيير أنبوب PBS لإعداد أنبوب عينة إفراز مجرى الهواء.
- عندما يتم وضع العينة في خزان العينة ، قم بتشغيل المضخة التمعجية واضبط معدل التدفق على 4 مل / دقيقة (الشكل 1C ، D).
- عندما يصل حجم العينة إلى الحجم المحدد (~ 1 مل) ، أوقف العملية وافصل أنبوب السيليكون. < / >
ملاحظه: الطريقة المقترحة أكثر كفاءة في تقليل حجم كبير من المخفف (>50 مل) إلى حجم أنبوب الطرد المركزي الصغير (~ 1 مل) (الشكل 2).
