Method Article

التصور من الحمض النووي المؤتلف والمجمعات البروتين باستخدام الميكروسكوب القوة الذرية

DOI:

10.3791/3061

⸱

July 18th, 2011

 ,  , 
1College of Nursing, Interdisciplinary Life Sciences Research Laboratory, Seattle University, 2College of Science and Engineering, Interdisciplinary Life Sciences Research Laboratory, Seattle University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووصف التنصت وضع مجهر القوة الذرية (AFM) طريقة لتصور DNA البلازميد ، بروتينات حشوية ، والمجمعات الحمض النووي والبروتينات. الأسلوب يشمل النهج البديل لإعداد العينات للتصوير فؤاد التالية التلاعب البيوكيميائية. ويلاحظ والتي تحتوي على الحمض النووي محددة التفاعل البروتين المناطق العازلة في ظروف شبه فيزيولوجي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قوة ذرية المجهر (فؤاد) يسمح للتصور الفردي للبروتينات ، جزيئات الحمض النووي ، ومجمعات البروتين البروتين ، والمجمعات الحمض النووي والبروتينات. في نهاية ناتئ المجهر هو تحقيق نانو النطاق الذي يخترق المناطق صورة تتراوح بين نانومتر وميكرومتر ، وقياس الارتفاع من الجزيئات يستريح على سطح الركيزة في أي لحظة معينة. القوات الكهروستاتيكية تسبب البروتينات والدهون والأحماض النووية لإرفاق فضفاضة إلى الركيزة في التوجهات العشوائية والسماح التصوير. البيانات التي تم إنشاؤها تشبه الخريطة الطوبوغرافية ، حيث حل والجزيئات ثلاثية الأبعاد من أحجام الجسيمات منفصلة (الشكل 1) 1،2. التنصت وضع فؤاد ينطوي على التذبذب المتكرر للتعزية ، والذي يسمح التصوير من المواد الحيوية لينة نسبيا مثل الحمض النووي والبروتينات. واحدة من فوائد ملحوظة من فؤاد على غيرها من تقنيات النانو المجهري هو قدرتها على التكيف النسبي لتصور البروتينات الفردية والجزيئات في مجمعات المخازن المائية ، بما في ذلك شبه فيزيولوجي ظروف تخزينها مؤقتا ، في الوقت الحقيقي ، ودون تلوين أو طلاء العينة ليتم طباعتها.

الطريقة المعروضة هنا يصف التصوير من الحمض النووي وعامل النسخ immunoadsorbed (أي مستقبلات جلايكورتيكود ، GR) مخزنة في محلول (الشكل 2). ويمكن فصل البروتينات والمجمعات Immunoadsorbed البروتين من بيليه الأجسام المضادة immunoadsorbing حبة من روح التنافس مع الأجسام المضادة وحاتمة ثم التقط (الشكل 2A). وهذا يسمح للتلاعب البيوكيميائية من الجزيئات الحيوية التي تهم قبل التصوير. المنقى مرة واحدة ، يمكن أن تكون مختلطة الحمض النووي والبروتينات ويمكن تصوير مجمع التفاعل الناتجة كذلك. الربط من الحمض النووي لالميكا يتطلب الموجبة ثنائي التكافؤ 3 ، مثل Ni 2 + 2 + أو Mg ، والتي يمكن أن تضاف إلى مخازن العينة بعد الحفاظ على نشاط البروتين. باستخدام نهج مماثل ، وقد استخدمت لتصوير فؤاد الانزيمات الفردية ، بما في ذلك بوليميريز الحمض النووي الريبي (4) وانزيم تصليح 5 ، منضما إلى جدائل الحمض النووي الفردية. هذه التجارب تعطي تفسيرا واضحا في البروتين البروتين والحمض النووي والبروتينات البيوفيزيائية التفاعلات التي تحدث على المستوى الجزيئي. يمكن للجسيمات التصوير الجزيئات الفردية مع فؤاد مفيدا لتحديد الجسيمات التجانس ولتحديد الترتيب الفعلي للعناصر المكونة للجسيمات تصوير. بينما تم تطوير الطريقة الحالية لرؤية خيوط GR - البروتين والحمض النووي كوصي 1،2 المجمعات التي يمكن ربط الموارد الوراثية ، ويمكن تطبيقه على نطاق واسع لعينات الحمض النووي والتصوير والبروتين من مصادر متنوعة.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الحمض النووي والبروتينات العينات المراد تصويره خالية من الملوثات

  1. عزل الجزيئات الحيوية ليمكن تصوير وضعها في المخزن مائي مناسب. يتبع امتزاز مناعي يمكن تنقية البروتينات ليمكن تصوير باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة 6 ، عن طريق إزالة الأجسام المضادة وبيليه 1،2 ، أو تنقية Profinity الدقيق وإزالة علامة 7 (الشكل 2A). عزل جزيئات الحمض النووي ليمكن تصوير بواسطة تنقية miniprep (2B الشكل).
  2. تأكيد تكوين ونقاء عينات البروتين ليمكن تصوير باستخدام SDS - PAGE والغربية النشاف. عن الحمض النووي ، وتأكيد تسلسل والنقاء من خلال استكمال خلاصة القيد وagarose هلام إستشراد.
  3. احتضان العينات في المخزن فؤاد الامتزاز لتشجيع الانضمام للعينة لالميكا. للحصول على عينات من البروتين ، يمكن استخدام 10 العازلة HEPES ملم. ويمكن إضافة أملاح قوة إضافية منخفضة الأيونية أو العوامل المساعدة الأخرى كذلك. لعينات من الحمض النووي ، وتشمل الموجبة ثنائي التكافؤ (مثل المغنيسيوم أو 2 + 2 + ني) لتعزيز الركيزة الامتزاز في الميكا. والمغنيسيوم مناسبة 2 + العازلة التي تحتوي على الحمض النووي لهو 10 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 ، 10 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 مم MgCl 2 3. وني البديل 2 + عازلة هو 10 ملي HEPES ، ودرجة الحموضة 6.8 و 10 ملي NiCl 2.
  4. تمييع العينة إلى تركيز من 5 ميكروغرام / مل في الامتزاز العازلة. المزيج بلطف. متجر على الجليد في حين يجري حاليا إعداد المجهر.

2. تصاعد فؤاد التحقيق

  1. مكان التحقيق خلية السائل حائز على محطة لرسو السفن ناتئ المقابلة التثبيت.
  2. موقع منذ فترة طويلة ، ناتئ سميكة (المشار إليها باسم ناتئ في 'ب') لجنة التحقيق نيتريد حادة (SNL) رافعة لاستخدامها في التصوير. نقل بعناية لصاحب الخلية التحقيق السائل ، وضمان أن يظل طرف في وضع مستقيم. ملاحظة فنية : قد يجب إيلاء العناية القصوى في حين أن التحقيق في العبور ، وإسقاطه من أي ارتفاع الضرر أو تدمير ناتئ أو التلميح. ويمكن استخدام SNL microlever (MSNL) التحقيق كبديل لجنة التحقيق SNL.
  3. إزالة حامل المسبار من محطة لرسو السفن ودراسة التظلل تحت المجهر ضوء لضمان أنها سليمة والجلوس بشكل صحيح في حامل الخلية التحقيق السائل.
  4. إزالة بعناية رئيس فؤاد من الصك تتوافق التجمع من خلال تشديد المشبك رئيس مخرش المسمار. ملاحظة فنية : قد يجب إيلاء العناية القصوى في حين التلاعب رئيس فؤاد ، وإسقاطه من مسافة قصيرة حتى (على سبيل المثال إذا لم يكن جالسا بشكل صحيح في التجمع تتوافق) تسبب ضررا كبيرا.
  5. عكس رئيس فؤاد ، ودفع بقوة التحقيق خلية السائل على صاحب المسامير الأربعة في قاعدة للرئيس فؤاد. عودة رئيس فؤاد بعناية إلى أداة تتوافق التجمع. الافراج عن رئيس مخرش المسمار المشبك لربط رئيس فؤاد في الصك.

3. تحديد موقع طرف ناتئ ، والانحياز ليزر ، وتعديل photodetector

  1. باستخدام أداة البرمجيات فؤاد ، موقع الحافة ناتئ عن طريق تحريك المقابض للمجهر الضوء على متن الطائرة. ضبط إضاءة المجهر إذا لزم الأمر لتحسين تحديد الحافة. تجلب نهاية طرف ناتئ الى مقربة من مرمى المعروضة على برنامج الصك.
  2. جلب رأس ناتئ الى التركيز من خلال تعديل الأسهم صعودا وهبوطا وحدة تحكم البصريات على البرنامج. استخدام بطيء (S) أو متوسطة السرعة (M) ، في حين ضبط البصريات.
  3. محاذاة الليزر لطرف ناتئ باستخدام المقابض التكيف الليزر. تحريك المقابض التكيف حتى النقطة الحمراء ليزر داخل بقعة الإضاءة البيضاء. التتبع على طول الذراع ناتئ باستخدام نمط التعرج حتى يتم وضع الليزر على الطرف ناتئ. عند محاذاة بشكل صحيح ، فإن بقعة انعكاس قوية تظهر في النافذة الأمامية للرئيس فؤاد.
  4. مركز photodetector عن طريق ضبط المقابض photodetector على رأسه فؤاد. هذا وسوف محاذاة نقطة الليزر في مرمى لعرض photodetector من البرنامج الصك. وينبغي الإشارة مجموع وحظ أن حوالي 4-6.

4. المواقع فؤاد الرأس وناتئ توليف

  1. وضع ورقة المشقوق حديثا من الميكا تعلق على عينة معدنية القرص فؤاد على صاحب العينة الممغنطة فوق لوحة حامل فؤاد. وسيتم استخدام هذا الإعداد لموقف رئيس فؤاد قبل التصوير لعينة من الحمض النووي أو البروتينات أعدت في الخطوة 1.
    1. ملاحظة فنية : لصاحب العينة الممغنطة وسائل التحقيق حامل الخلية هي أكثر سمكا من عينة أخرى آليات الربط وأصحاب التحقيق. إذا كان هناك في الوقت الراهن غير كافية التخليص بين الجمعية حامل الميكا عينة ورئيس فؤاد ، حرك رأسه فؤاد تصل عن طريق اختيار رمز سحب على البرنامج أداة عدة مرات.
  2. تدوير حامل لوحة فؤاد بحيث يتم وضع القرص العينة لتصوير الأولي. ضمان يتركز الركيزة الميكا تحت رأسه فؤاد.
  3. تحريك الرأس إلى الأسفل نحو AFMسطح القرص الميكا ، باستخدام عينة مراقبة سطح تركيز البرنامج الصك. حدد المتوسطة (M) على سرعة المحرك Z ، وتستمر نحو السطح حتى رئيس فؤاد حوالي 2 ملم فوق الميكا. في هذا الوقت ، والتحول إلى استخدام بطيء (S) سرعة المحرك Z من أجل تجنب الاتصال المفاجئ بين التحقيق والسطح (ويشار إلى تحطمها غيض).
  4. الشروع في نقل التحقيق أقرب إلى سطح الركيزة الميكا حتى سمات مميزة على سطح الميكا أو انعكاس طرف في التركيز. تبديل بين المياه السطحية والطائرات انعكاس غيض الاتصال به "التركيز على ما يلي :" رمز من برنامج الصك.
  5. حدد رمز النغمة من برنامج الصك وتوليف ناتئ. تردد صدى للSNL الموصى بها وتحقيقات ناتئ MSNL هو 20-60 كيلو هرتز. تحديد الذروة 5 ٪ الإزاحة. ملاحظة فنية : ضبط ناتئ الكافي ضروري للتصوير عينة كافية.

5. تصوير سطح العينة الميكا

  1. إشراك لجنة التحقيق على سطح الميكا. مجموعة أولية حجم المسح الضوئي إلى 10 ميكرون ومعدل المسح إلى 1 هرتز. ويمكن الحصول على مكاسب لا يتجزأ وتعيين النسبي في البداية إلى 0.2 و 0.4 على التوالي. ضبط المكاسب حسب الحاجة من أجل الحصول على تتبع وفحص بالاشعة تقفي أثر تداخل تقريبا. وخفض setpoint السعة زيادة التفاعل بين لجنة التحقيق والميكا وضمان المشاركة.
  2. التقاط صور المسح الشامل للحقل 10 ميكرون. انخفاض حجم المسح إلى 5 ، 1 ، 0،5 ميكرون ، والتقاط الصور وكاملة من كل حقل. ضبط معدل المكاسب وتفحص عند الضرورة. التقاط الصور من سطح الميكا يوفر الأساس لمقارنة الحمض النووي والبروتينات التي تحتوي على عينات.
  3. فك الارتباط التحقيق مع بنقرة واحدة على أيقونة البرنامج على فك الارتباط الصك.

6. الجزيئات الحيوية التي تهم التصوير

  1. المزيج برفق عينة الحمض النووي أو البروتينات أعد في الخطوة 1 والاستعداد لتحميله على سطح الميكا تصوير. 5 ميكروليتر مزيج من العينة مستعدة مع 45 ميكرولتر من العازلة الامتزاز الطازجة (نهائي تركيز العينة = 0.5 ميكروغرام / مل).
  2. إضافة بعناية ميكرولتر من 50 ميكروغرام 0.5 / مل حل التي تحتوي على جزيء حيوي مباشرة على سطح الميكا. القيام بذلك دون نقل التحقيق أو رئيس فؤاد ، وضمان حل العينة (ولكن ليس طرف الماصة) يجعل الاتصال مع التحقيق.
  3. وقفة 5 دقائق للسماح للالجزيئات الحيوية في العينة إلى الانضمام إلى السطح الميكا.
  4. في ختام لمدة 5 دقائق ، الماصة اضافي 50-100 ميكرولتر من العازلة الامتزاز في حامل الخلية التحقيق السائل الحرص على عدم لمس المجس ، رئيس فؤاد ، أو الميكا مع طرف الماصة. وسوف تشكل هذه هلالة ، والسماح لفؤاد التنصت وضع التصوير في السوائل. ويبين الشكل 3 الترتيب النهائي للخلية السائل ، ناتئ ، العينة ، صاحب العينة ، والغضروف المفصلي.
  5. إعادة ضبط photodetector وإعادة تنظيم ليزر للتعزية عند الضرورة. معقد عرض تلميح التحقيق والمحاذاة ليزر نظرا لنمط حيود التي تسببها مضيفا العازلة العينة إلى صاحب التحقيق : مذكرة التقنية. retune يدويا ناتئ ، إذا لزم الأمر.
  6. إعادة إشراك التحقيق باستخدام أداة البرمجيات. ضبط الانحراف الرأسي ، وكسب لا يتجزأ ، واكتساب النسبي حسب الضرورة. هذا وسوف تبدأ عملية إعادة تصوير مقطع من الميكا الممسوحة فورا قبل إضافة عينة والتقاط الصور.
  7. زيادة حجم مسح (500 نانومتر - 10 ميكرون) لتحديد المناطق ذات الأهمية. والتكبير في خفض معدل المسح إلى 0.5 هرتز لتحسين دقة الصورة
  8. مرة واحدة التصوير اكتمال التحقيق فك الارتباط عن طريق تحديد سحب رمز البرنامج على صك عدة مرات. ضمان إزالة كافية بين الرأس والقرص فؤاد العينة قبل تفكك خلية السائل أو القرص العينة.
  9. شطف جيدا التحقيق خلية السائل صاحب العينة والقرص مع الماء المقطر لمنع تشكيل بلورات الملح من حيث يتبخر المتبقية العازلة الامتزاز. الجافة مع الهواء المضغوط.

7. ممثل النتائج :

وعرضت أمثلة من الصور AFM في الشكل 4. الميكا الركيزة (A) على سطح مستو جزيئيا على الحمض النووي والبروتينات التي يمكن أن تمتص. التصوير الميكا قبل عينات جزيء حيوي يوفر السيطرة السلبية وتقييم الضوضاء التصوير. كما يوفر مستوى من الضمانات التي يتم ضبطها بشكل صحيح ناتئ والتصوير عينة اللاحقة سوف يكون ناجحا. يتم التعرف بسهولة المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي البلازميد (B ، D) ، supercoiled المفترض ، من خلال مظهرها غير متماثلة وموحدة إيداع على الركيزة الميكا غير ملحوظة سابقا. مجمعات البروتين من أحجام الجسيمات الرصينة (C ، E) هي أيضا مميزة فريدة من الركيزة الميكا. الاختلافات حجم الجسيمات تبين عدم تجانس العينة ، ويمكن أن تكون مفيدة لتقريب رياضيات الكيمياء بروتين معقد أو النشاط البيوكيميائية. الشكل العام قطري ، وثابت من التوجه المواليجزيئات البروتين لوحظ في الفريق C قطعة أثرية والتصوير ، والبروتينات وسيكون متوقعا المنحى على الركيزة الميكا بطريقة عشوائية. الأسباب المحتملة لهذا الأثر لاحظ هو غيض المادية أو شذوذ في AFM التصوير السريع جدا من معدل المسح الضوئي. بينما الطرف الإلتواء (مبين في الشكل 1B) يمنع المطلقة حسابات قياس طول مايو المحاور x و y وقياس الارتفاع (ض محور) و x النسبية وقياسات ذ مفيدا مع ذلك لتقدير الخصائص الفيزيائية الحيوية الجزيئات الحيوية للتصوير.

figure-protocol-1
الشكل 1 : عرض تخطيطي للاستفادة من الوضع المجهري القوة الذرية (AFM). A ، المجهر. في نهاية ناتئ هو غيض الحادة التي تتأرجح صعودا وهبوطا كما يمسح على سطح الركيزة الميكا الذي كثف مجمعات الجزيئية البيولوجية. كما الماسح يتحرك في اتجاهات x و y ، ينعكس شعاع الليزر من الجزء الخلفي للناتئ على موقف حساسة للكشف عن الثنائي الضوئي لرسم خريطة العمودي (ض) المسافة غيض التحركات لأنها تمر عبر مجمعات الجزيئية البيولوجية جالسا على الميكا. باء تشويه للصورة في الاتجاهين x و y التي تسببها الإلتواء الحافة. في دائرة نصف قطرها الاسمي من طرف نيتريد السيليكون التقليدية هي أكبر من الجزيئات يمكن تصوير ، وعلى حافة الحافة الاتصالات العينة. كما يخترق السطح النتائج الإلتواء طرف في تصوير الجزيئات التي تظهر بشكل اكبر في الاتجاهين x و y ولكن ليس الاتجاه ض. ويمكن تقليل هذا التأثير عن طريق استخدام النصائح مع دائرة نصف قطرها أصغر غيض الاسمية.

figure-protocol-2
الشكل 2 : توضيحات من البروتين والحمض النووي immunoadsorbed إعداد العينة. بيان من مجمع GR immunoadsorbed • البروتين hsp70 من الأضداد وحيدة النسيلة (ماب) - A - Sepharose البروتين (PAS) بيليه. وسوف تفرخ immunopellet مع الببتيد الذي يحتوي على خريطة موقع حاتمة تسهيل الافراج عن GR • بروتين معقد hsp70 من بيليه ، مما يسمح بجمع معقدة من طاف وتصور من قبل فؤاد. B ، إعداد الحمض النووي للتصوير فؤاد يتطلب استخدام منطقة عازلة الموجبة الامتزاز ثنائي التكافؤ. وكاتيون ثنائي التكافؤ يزيد من تقارب من الحمض النووي لالركيزة الميكا.

figure-protocol-3
الشكل 3 : الترتيب النهائي للرئيس فؤاد ، السائل صاحب التحقيق الخلية ، العينة ، صاحب العينة ، وهلالة العازلة. ويجب اتخاذ العناية ، عند ايداع عينة والعازلة إضافية على الركيزة الميكا لتجنب الاتصال الجسدي بين طرف الماصة ورئيس فؤاد ، استدعاء السائل ، والركيزة الميكا. ب ، أ. التكبير وهلالة عازلة تمتد من القرص عينة لصاحب الخلية التحقيق السائل.

figure-protocol-4
الشكل 4 : micrographs القوة الذرية الركيزة الميكا (A) ، 2xGal4 - 2xGRE - DNA البلازميد luciferease 8 (B ، D) ، والموارد الوراثية • مجمعات البروتين hsp70 (C ، E) مخزنة في الحل. الميكا بمثابة صورة للمقارنة مع السيطرة على تصورات من الحمض النووي والبروتينات. وأعدت GR • مجمعات البروتين hsp70 بواسطة امتزاز مناعي من GR معبي مع hsp70 ثم أفرج عنه من الأجسام المضادة بيليه حبة باستخدام خريطة موقع الضد المتنافسة (موضح في الشكل 2A). وقد أعدت بواسطة الحمض النووي البلازميد miniprep التقليدية. لوحات A ، B ، C ويتم من التكبير ما يعادل (الحانات النطاق = 200 نانومتر) ، وكذلك لوحات D و E (الحانات النطاق = 40 نانومتر).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فؤاد يوفر تقنية فريدة من نوعها مجهرية قادرة على الجزيئات الحيوية الفردية غير المصقول في التصوير المائي وقرب حلول فيزيولوجي مخزنة في الوقت الحقيقي. وهذا يسمح للتصور من البروتينات الفردية وجزيئات الحمض النووي ، فضلا عن المجمعات والمجمعات multiprotein بالبروتين الحمض النووي. يمكن أن جزيئات الجزيئات التصوير مع فؤاد مفيدا لتقييم تجانس العينة وتحديد الترتيب الفعلي للعناصر المكونة للجسيمات ملاحظتها. ويمكن ملاحظة هذا النهج من جزيئات الجزيئات الفردية أن تكون إضافة مفيدة لتقنيات الكيمياء الحيوية التقليدية ، مثل فحوصات مناعي ، بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام ، واللوني حجم العمود الاستبعاد ، والتي توفر بيانات تلخيصي كبيرة تمثل 10 3 11 -10 مجمعات الجزيئية البيولوجية لمصلحة فرد موجود في العينة.

يمكن لجميع البحوث في رياضيات الكيمياء متعدد البروتينات ، والتفاعلات الجزيئية البيولوجية ، ومتطلبات العامل المساعد يتم التحقيق باستخدام فؤاد. ويمكن تكييف الطريقة المعروضة هنا لاستيعاب الأسئلة البيوفيزيائية محددة من الفائدة. على سبيل المثال ، وذلك باستخدام مسبار خلية السائل حامل قادرة على تبادل العازلة ، فمن الممكن لمتطلبات الفحص العامل المساعد لتكوين البروتين المعقدة. يمكن تشكيل الحمض النووي والبروتينات وفصلها في التجمعات القريبة من الوقت الحقيقي ، وحتى في الوقت الذي يجري تصويره. يمكن توليد الحمض النووي مع تسلسل محدد من الفائدة (على سبيل المثال عناصر الاستجابة الظني ، أو رواية تسلسل البروتين ملزمة) ، مختلطة مع بروتين الربط الافتراض ، وتصوير لتقديم أدلة مباشرة على التفاعلات بين الجزيئات.

التنصت على وضع التصوير فؤاد هو الى حد كبير أقل تعقيدا إذا تستخدم العينات الجافة بدلا من العينات في المحاليل المائية ، وتقف على الحمض النووي DNA الخطية والبلازميدات دائرة مغلقة على حد سواء تم تصويره في هذا السبيل 3،9. الأسلوب المقدمة هنا تستخدم عينات مخزنة في الحلول من أجل توفير بيئة التصوير أكثر الفسيولوجية. وينبغي أيضا أساليب أخرى جديرة بالذكر من البروتينات التصوير النظر فيها ، بما في ذلك مجال الأشعة تحت الحمراء القريبة من المجهري 10. الاستخدام المتكامل للامتزاز مناعي في القرين مع فؤاد يوفر فرصة لإعداد مجموعة كبيرة من المجمعات البروتين ، وذلك باستخدام تقنيات راسخة البيوكيميائية ، وتصور لهم ثم بعد الإفراج عن بيليه الأجسام المضادة حبة immunoadsorbing. على سبيل المثال ، كان يعاير GR immunoadsorbed لارتباطه مع البروتين hsp70 كوصي الجزيئية (1) ، وكذلك البروتين السيارات داينين ​​2 باستخدام هذا النهج من أجل تقدير حجم التعقيد وstoichiometries. حجم الجسيمات وخصائص الفيزيائية الحيوية (مثل الصلابة) كانت مفيدة في التحقق من هوية الجزيئات الحيوية التي لوحظت في عينات من تصوير فؤاد 11،12. ومن الممكن أيضا لتأكيد الهوية جزيء حيوي عن طريق إضافة لجزيء حيوي التفاعل (مثل ليجند أو ريتوكسيماب) ، التي من شأنها ربط هدفها وتسبب زيادة حجم الجسيمات إذا كان الهدف هو جزيء حيوي الحالي.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM086822 المنحة. فإن الكتاب أود أن أشكر الدكاترة. أليك Pakhomov والاس بول (جامعة تقنية النانو واشنطن مرفق المستخدم (NTUF)) واندريا سليد (بروكر AXS) لما قدموه من مساعدة تقنية من الخبراء. وقد أجريت DNA فؤاد التصوير في جامعة. واشنطن NTUF ، وهو عضو في شبكة تقنية النانو البنية التحتية الوطنية. ويعود الفضل في البلازميد 2xGal4 - 2xGRE - luciferease من قبل المختبر الدكتور كيث ياماموتو (جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة فهرس العدد
البعد 3100 بروكر البعد 3100
البعد السوائل الخليوي بروكر DTFML - DD - سعادة
رافعة حادة نيتريد (SNL) السيليكون نيتريد فؤاد التحقيق بروكر SNL - 10
Microlever حادة رافعة نيتريد (MSNL) السيليكون نيتريد فؤاد التحقيق بروكر MSNL - 10
NanoScope البرمجيات فؤاد الصك بروكر 004-132-000
أقراص معدنية فؤاد العينة تيد بيلا 16208
الصف V1 أقراص ميكا ، 12 مم تيد بيلا 50-12

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J Biol Chem. 278, 34764-34773 (2003).
  2. Harrell, J. M. Evidence for glucocorticoid receptor transport on microtubules by dynein. J Biol Chem. 279, 54647-54654 (2004).
  3. Pastre, D. Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study. Biophys J. 85, 2507-2518 (2003).
  4. Guthold, M. Direct observation of one-dimensional diffusion and transcription by Escherichia coli RNA polymerase. Biophys J. 77, 2284-2294 (1999).
  5. Petrucco, S., Volpi, G., Bolchi, A., Rivetti, C., Ottonello, S. A nick-sensing DNA 3'-repair enzyme from Arabidopsis. J Biol Chem. 277, 23675-23683 (2002).
  6. Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J Biol Chem. 280, 33792-33799 (2005).
  7. Ruan, B., Fisher, K. E., Alexander, P. A., Doroshko, V., Bryan, P. N. Engineering subtilisin into a fluoride-triggered processing protease useful for one-step protein purification. Biochemistry. 43, 14539-14546 (2004).
  8. Meijsing, S. H., Elbi, C., Luecke, H. F., Hager, G. L., Yamamoto, K. R. The ligand binding domain controls glucocorticoid receptor dynamics independent of ligand release. Mol Cell Biol. 27, 2442-2451 (2007).
  9. Shen, X. C. A simple and effective sample preparation method for atomic force microscopy visualization of individual DNA molecules in situ. Mol Biol Rep. 38, 965-969 (2010).
  10. Paulite, M., Fakhraai, Z., Akhremitchev, B. B., Mueller, K., Walker, G. C. Assembly, tuning and use of an apertureless near field infrared microscope for protein imaging. J Vis Exp. , (2009).
  11. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. J Vis Exp. , (2010).
  12. Brunger, A. T., Weninger, K., Bowen, M., Chu, S. Single-molecule studies of the neuronal SNARE fusion machinery. Annu Rev Biochem. 78, 903-928 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atomic Force MicroscopyDNA ImagingProtein ComplexesBiomolecule VisualizationTapping Mode AFMMica SubstrateBuffer ConditionsCantilever TuningProbe AlignmentReal time Imaging

Related Articles