تقنية تزقيم داخل المعدة لعدوى هيليكوباكتر الخاضعة للرقابة في الفئران

الملخص

المصدر: D'Costa ، K. et al. ، نماذج الفئران لعدوى الملوية وأمراض المعدة.J. Vis. Exp.(2018)

يوضح هذا الفيديو إنشاء عدوى هيليكوباكتر بيلوري من خلال تقنية التزوين داخل المعدة في نموذج الفأر. يتم إعطاء المعلق البكتيري عن طريق قسطرة يتم إدخالها عبر الفم إلى المعدة. تستعمر البكتيريا الملقحة وتؤسس عدوى في المعدة ، والتي يمكن استخدامها لدراسة التفاعل بين المضيف والممرض.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< ص الفئة = "jove_title" >1. نمو وتحضير اللقاح البكتيري

1. قم بإذابة مخزونات الجلسرين من هيليكوباكتر بيلوري (H. pylori) أو H. felis من -80 درجة مئوية والزراعة الفرعية على صفائح أجار دم الحصان (HBA) التي تتألف من: قاعدة أجار الدم رقم 2 (انظر جدول المواد) ؛ "مكمل انتقائي للمضادات الحيوية في Skirrow" معدل (يتكون من فانكومايسين ، 10 ميكروغرام / مل ؛ بوليميكسين ب ، 25 نانوغرام / مل ؛ تريميثوبريم ، 5 ميكروغرام / مل ؛ الأمفوتريسين ب ، 2.5 ميكروغرام / مل) ؛ و 5-10٪ (V / v) دم الحصان. تنمو البكتيريا جيدا في ظل الظروف الهوائية الدقيقة في برطمانات لاهوائية سعة 2.5 أو 3.5 لتر تحتوي على عبوات الغاز المناسبة (انظر جدول المواد) ، عند 37 درجة مئوية < br / > ملاحظة: يجب استزراع سلالات الملوية البوابية المزروعة في ظل هذه الظروف بعد 1-1.5 يوم من الحضانة ، بينما بالنسبة إلى H. felis ، يلزم بشكل عام ما لا يقل عن يومين من الحضانة. تم وصف الثقافة المناسبة ووسائط التخزين بالتفصيل سابقا.
2. تحضير لقاح بكتيري لعدوى الفئران من مزارع المرحلة اللوغاريتمية المبكرة إلى المتوسطة. احصد البكتيريا برفق من ألواح الأجار عن طريق إغراق كل طبق ب 1-2 مل من مرق تسريب القلب في الدماغ (BHI). معلقات السحب من الألواح باستخدام ماصات باستور.
   1. بدلا من ذلك ، قم بإعداد لقاح من بكتيريا هيليكوباكتر التي تم نشرها في مرق BHI لمدة 16-18 ساعة. في هذه الحالة ، اجمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة عند 2,200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
3. تقييم صلاحية البكتيريا وحركتها من خلال فحص مستحضرات التركيب الرطب تحت الفحص المجهري الطور (هدف 100X). قم بإعداد حوامل مبللة عن طريق تعليق حلقة من البكتيريا في قطرة 10-20 ميكرولتر من مرق BHI على شريحة مجهر زجاجي. في حالة بكتيريا الملوية البوابية، وهي بكتيريا أكبر بكثير من بكتيريا الملوية البوابية، استخدم مقياس كثافة الدم لحساب عدد البكتيريا القابلة للحياة بدقة. تأكد من نقاء الثقافة عن طريق إجراء صبغة جرام.
   ملاحظه: استخدم لقاح الملوية البوابية فقط إذا كانت غالبية البكتيريا لها شكل عصوي أو حلزوني (يمكن أن يختلف التشكل حسب السلالة). يجب أن تحتوي لقاح الملوية البوابية بشكل أساسي على بكتيريا حلزونية الشكل.لا تستخدم اللقاح إذا كانت معظم البكتيريا لديها مورفولوجيا الكوكويد ، لأن هذه الأشكال غير قابلة للحياة ولن تؤدي إلى الإصابة بالفئران.
4. تقدير عدد البكتيريا في اللقاح عن طريق عد العدد التقريبي للبكتيريا لكل حقل تحت الفحص المجهري الطور (هدف 100X) وباستخدام الدليل التالي: 1 بكتيريا لكل حقل = حوالي 10⁶ وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) من هيليكوباكتر / مل ؛ 10 بكتيريا لكل حقل = حوالي 10⁷ CFU / مل ؛ 100 بكتيريا لكل حقل = حوالي 10⁸ CFU / مل ، الخ.
   1. عند استخدام مقياس الدم ، احسب CFU / مل باستخدام الصيغة التالية:
      CFU / مل = (متوسط عدد البكتيريا في حقل 4 × 4) × (عامل التخفيف) × (10⁴).
5. اضبط كثافة الخلايا البكتيرية لللقاح إلى حوالي 10^{7-10 8} CFU / مل عن طريق التخفيف في مرق BHI ، إذا لزم الأمر.
   1. لضمان أقصى قدر من الجدوى البكتيرية ، استخدم لقاح التزقيم داخل المعدة في أسرع وقت ممكن بعد التحضير.
   2. تأكد دائما من كثافة خلايا الملوية البوابية وقابليتها للحياة عن طريق إجراء عد قابل للتطبيق لللقاح مباشرة بعد إجراء التزقيم (انظر أدناه). هذا ليس ممكنا دائما بالنسبة ل H. felis ، لأنه لا يشكل عادة مستعمرات معزولة على وسائط الاستزراع. لا يمكن تحديد أعداد هيليكوباكترالقابلة للحياة في اللقاح عن طريق قياس الكثافة الضوئية (A₆₀₀) وحدها لأن هذه الطريقة لا تميز بين البكتيريا القابلة للحياة (أي العصية / الحلزونية / الحلزونية) وغير القابلة للحياة (أي الكوكويد).
   3. استخدم قيم الكثافة الضوئية كوسيلة لتقدير أعداد بكتيريا الملوية البوابية القابلة للحياة في العين ، ولكن في هذه الحالة ، من الضروري أولا إنشاء منحنى نمو. لهذا الغرض ، تتم مراقبة قيم_{A 600} من ثقافات الملوية البوابية بمرور الوقت وترتبط مباشرة بأعداد البكتيريا القابلة للحياة ، والتي يتم تحديدها عن طريق عد الألواح. < / > ملاحظه: تتمثل إحدى الطرق الملائمة لإجراء تحديدات منحنى النمو هذه في زراعة البكتيريا في وسط سائل (القسم 1.2) ، باستخدام قوارير زراعة الأنسجة المسطحة القاع القياسية الموضوعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 10}٪. ثم تتم مقارنة أعداد CFUs ، التي تم تحديدها من حصص الثقافات التي تم الحصول عليها كل 4-6 ساعات على مدار 2-3 أيام ، بقيم A₆₀₀ المقابلة. الأهم من ذلك ، يجب إنشاء منحنيات النمو لكل سلالة من سلالات الملوية البوابية ، حيث قد تنمو بمعدلات مختلفة ، علاوة على ذلك ، لا تنمو جميع السلالات بشكل جيد في 10٪ من ثاني أكسيد الكربون_.

< p class = "jove_title" >2. تزقيم الفئران المصابة بالملوية

المعدة

ملاحظة: يمكن تطبيق طريقة التزقيم داخل المعدة هذه على الأنواع البكتيرية الأخرى التي تستعمر الأمعاء مثل S. Typhimurium و C. rodentium و Listeria monocytogenes.

1. استخدم الفئران من الذكور أو الإناث البالغة من العمر 6-8 أسابيع وخالية من مسببات الأمراض (SPF) وخالية من هيليكوباكتر. استخدم ذات الخلفية الوراثية C57BL / 6 لتجارب العدوى بالملوية البوابية أو الملوية البكتيرية اللولية. في هذه الدراسة ، استخدمنا الفئران من النوع البري (WT) والمعدل وراثيا C57BL / 6 التي تفتقر إلى مستقبل مناعي فطري رئيسي (تسمى بالضربة القاضية أو KO).
   ملاحظه: يمكن أيضا استخدام الفئران ذات الخلفيات الجينية الأخرى لعدوى هيليكوباكتر ، ومع ذلك ، قد تتأثر مستويات الاستعمار وشدة المرض بنوع خلفية المضيف.
2. استنشق اللقاح البكتيري (الخطوة 1.5) في محاقن يمكن التخلص منها سعة 1 مل واستبدل الإبر المرفقة بإبرة قياس 23 يتم لصق عليها قسطرة البولي إيثيلين التي تستخدم لمرة واحدة (الطول ، 6-8 سم ؛ القطر الداخلي ، 0.58 مم). اربط القسطرة بالإبر عن طريق تطبيق شرائط صغيرة من الأغشية البلاستيكية (انظر جدول المواد). بدلا من ذلك ، استبدل مجموعة الإبرة / القسطرة باستخدام أنابيب تغذية بلاستيكية معقمة (مقياس 20 × 38 مم).
3. كبح جماح الفئران جسديا بقبضة قوية على قفص الرقبة والذيل.
   ملاحظه: يمكن إجراء هذا الإجراء بدون تخدير ، أو بدلا من ذلك ، باستخدام مخدر مستنشق ، مثل ميثوكسي فلوران أو إيزوفلوران.
4. أدخل القسطرة في منتصف الفك المفتوح ووجهها في اتجاه ذيلية باتجاه المريء. قم بتمديد عنق الفأر للسماح بسهولة الوصول إلى المعدة من خلال المريء (وبعيدا عن القصبة الهوائية) حتى تختفي معظم القسطرة أو كلها وتشعر بالمقاومة ، بما يتوافق مع قاعدة المعدة. قم بتسليم حصة محددة ، عادة 100 ميكرولتر لكل تلقيح (الشكل 1).
   ملاحظه: يجب أن تكون الفئران مخزنة مع ≥ 10⁵ CFU لضمان الاستعمار الأمثل وأمراض الأمراض.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: صورة توضح تقنية التزقيم عن طريق الفم. يتم استخدام حقنة 1 مل يمكن التخلص منها وقسطرة مرنة لتوصيل ≥10⁵ CFU من اللقاح البكتيري إلى الفأر عبر الطريق داخل المعدة. تم تخدير الفأر باستخدام ميثوكسي فلوران وتم تثبيته بقبضة قوية على الرقبة ، مما يسمح بوصول القسطرة إلى المعدة عبر المريء.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الكواشف البكتريولوجية قاعدة أجار الدم الأكسويد رقم 2 ثيرمو فيشر العلمي CM0271B يذوب في الماء منزوع الأنون قبل التعقيم دم الحصان الممتاز منزوع الضربات البيولوجيا الأخلاقية الأسترالية PDHB100 مرق تسريب القلب باكتو الدماغ BD Bioscience هاتف: 237500 يذوب في الماء منزوع الأنون قبل التعقيم حزم غاز CampyGen ثيرمو فيشر العلمي CN0035A / CN0025A الكواشف الأخرى ميثوكسي فلوران (بنتروكس) المنظمة الدولية للتطوير الطبي لا ينطبق المعدات والأواني البلاستيكية الجرار اللاهوائية الأكسويد ثيرمو فيشر العلمي HP0011 / HP0031 كوبان باستور ماصات خدمات Interpath 200 ع 01 جهاز الطرد المركزي Eppendorf 5810R اجمع الكريات البكتيرية عن طريق الطرد المركزي عند 2,200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية 23 جرام إبرة انزلاق دقيقة BD Bioscience 301805 بارافيلم م بيميس ، VWR PM996 أنابيب البوليثين ذات التجويف الدقيق Portex سميثس الطبية 800/100/200 قسطرة التغذية البلاستيكية مختبرات إنستيك FTP20-30 1 مل توبركولين لوير زلة المحاقن التي يمكن التخلص منها BD Bioscience 302100 مدقة Eppendorf الدقيقة لأنابيب 1.2 - 2 مل سيجما ألدريتش Z317314 مدقات البولي بروبلين القابلة للتعقيم المستخدمة في تجانس المعدة حلقة بلاستيكية معقمة لاب سيرف LBSLP7202