تحليل كثرة الخلايا الزعترية المبرمج بواسطة البلاعم البريتونية

الملخص

المصدر: Zhen، Y. et al.، التحليل التجريبي لابتلاع الخلايا الزعترية المبرمج بواسطة الضامة. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو إجراء لتحليل كثرة الخلايا البثرية بوساطة البلاعم البريتونية لخلايا الغدة الزعترية الفئرانية المبرمجة عن طريق الفحص المجهري الفلوري.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الخلايا الزعترية المبرمج المسمى CFSE

1. قم بالقتل الرحيم لفئران ساذجة C57 / B6 عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 10 دقائق وتشريح لفتح تجويف الصدر ، وإزالة (سحب) الغدة الصعترية باستخدام ملقط منحني ذو طرف رفيع في طبق بتري لزراعة الأنسجة يحتوي على 10 مل من RPMI1640 متوسط.
2. احصل على تعليق أحادي الخلية عن طريق طحن الغدة الصعترية بالكامل على طرفي بلوري من شرائح المجهر ثم قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر.
3. اجمع معلق الغدة الصعترية سعة 10 مل في أنبوب سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
4. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليقها في 40 مل من 1x PBS ، واحسب أرقام الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
5. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية.
6. قم بإعادة التعليق في 20 مل من 1x PBS في أنبوب سعة 50 مل كتعليق خلية واحدة مع ما يصل إلى 2 × 10⁸ خلايا (إذا كان أكثر من 2 × 10⁸ خلايا ، فأعد تعليق بقية الخلايا في 20 مل أخرى من 1 × PBS في أنبوب مختلف سعة 50 مل).
7. اصنع 5 ميكرومتر من CFSE بحجم متساو (20 مل) من 1x PBS في أنبوب منفصل سعة 50 مل عن طريق سحب 40 ميكرولتر من محلول مخزون CFSE (2.5 مل) إلى 20 مل من 1x PBS واخلطه جيدا عن طريق قلب الأنبوب 2-3 مرات.
8. أضف 20 مل من CFSE من الخطوة 1.7 إلى 20 مل من تعليق الخلية من الخطوة 1.6 (التركيز النهائي ل CFSE هو الآن 2.5 ميكرومتر).
   ملاحظه: لكل معلق خلية 20 مل ، هناك حاجة إلى أنبوب CFSE سعة 20 مل.
9. اقلب الخلية وأنبوب خليط CFSE 2-3 مرات واحتضان الخليط في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة أقصاها دقيقتين ، ثم أوقف التفاعل بإضافة 10 مل من مصل الحصان المعطل بالحرارة.
10. جهاز طرد مركزي خليط أنبوب سعة 50 مل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظه: إذا نجحت عملية وضع العلامات على CFSE ، فستصبح حبيبات الخلية صفراء فاتحة.
11. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 40 مل من 1x PBS وعد أرقام الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
قم
12. بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
13. اغسل حبيبات الخلية مرة أخرى ب 40 مل من RPMI1640 متوسط.
14. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا بوسط زراعة الأنسجة RPMI1640 (RPMI1640 ، 20 ملي مولار HEPES ، 10٪ FBS (معطل حراري) ، 20 ملي جلوتامين ، و 1x قلم / بكتيريا) بتركيز 7 × 10⁶ خلايا / مل في طبق زراعة أنسجة 100 ><مم. ملاحظه: إذا تم الحصول على المزيد من الخلايا ، فستكون هناك حاجة إلى طبق منفصل لزراعة الأنسجة مقاس 100 مم.
15. أضف ستاوروسبورين إلى مزرعة تعليق الخلية بتركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر وزراعته لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة المزودة ب 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2.}

< p class = "jove_title" >2. تحضير البلاعم البريتونية

1. حقن اثنين من الفئران C57B6 (أو أي فئران تم التلاعب بها جينيا في المختبر) داخل الصفاق مع 1 مل من 3٪ من ثيوغليكولات المعمارية في اليوم 0.
2. قم بالقتل الرحيم للفئران في اليوم 5 كما في الخطوة 1.1 ، وقم بقص وتقشير جلد البطن مع ترك الصفاق سليما. اغسل التجويف البريتوني عن طريق دفع 10 مل بسرعة من محلول الغسيل (RPMI1640 ، 2٪ FBS ، 0.04٪ EDTA) في التجويف البريتوني باستخدام حقنة سعة 10 مل متصلة بإبرة 18 جراما.
3. استرجع مخزن الغسيل المؤقت ببطء باستخدام نفس الإبرة / المحقنة واجمع مخزن الغسيل المؤقت في أنبوب سعة 50 مل.
4. اغسل التزقيم البريتوني مرتين باستخدام 1x PBS ، وأعد تعليق الضامة البريتونية في وسط زراعة الأنسجة RPMI1640 بكثافة 2 × 10⁶ خلايا / مل و 500 ميكرولتر في كل بئر من اللوحة المكونة من 24 بئرا. اترك الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 2 ساعة.
5. قم بإزالة الخلايا العائمة عن طريق الشفط واستبدالها ب 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج مرتين.
6. اختياريا ، أضف مثبط التيروزين لمستقبلات TAM ، RXDX-106 ، بتركيزات موضحة في أساطير الشكل في كل بئر من ثقافة البلاعم واحتضانها لمدة ساعتين أخرى.

< p class = "jove_title">3. الزراعة المشتركة للبلاعم البريتونية مع الخلايا الزعترية موت الخلايا الصعترية

1. اجمع الخلايا الزعترية المبرمجة من الخطوة 1 واغسلها ثلاث مرات بوسط RPMI1640. يمكن قياس كفاءة تحريض موت الخلايا المبرمج في هذه المرحلة باستخدام مجموعة Annexin V / 7-AAD.
2. قم بتوزيع 0 - 12 × 10⁶ خلايا (في وسط 500 ميكرولتر) في كل بئر من مزارع البلاعم من البروتوكول # 2 ، وفقا للترتيب التجريبي (على سبيل المثال ، انظر الشكل 1). هذا يجعل حجم الثقافة بالكامل يبلغ 1 مل في كل بئر من اللوحة المكونة من 24 بئرا. أضف الجسم المضاد المانع إلى المزرعة مباشرة قبل إضافة الخلايا الزعترية موت السبات.
3. استزراع خليط الخلية عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات في حاضنة زراعة الأنسجة المزودة ب 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
4. اغسل كل بئر من المزرعة باستخدام 1x PBS (يحتوي على 500 ميكرومتر EDTA) مرتين لإزالة الخلايا المبرمجة العائمة بحرية.
5. قم بتلطيخ البلاعم المرتبطة باللوحة باستخدام CD11b-PE في هذه المرحلة.
   1. اغسل البلاعم المرتبطة باللوحة بمخزن مؤقت للتلطيخ (1x PBS ، 1٪ BSA) مرة واحدة.
   2. أضف 200 ميكرولتر من محلول التلوين الذي يحتوي على 2 ميكرولتر CD11b-PE في كل بئر.
   3. احتضن الطبق عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
   4. اغسل كل بئر من اللوحة ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت للتلطيخ.
   5. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلوين واستمر في اللوحة لتحليل الصورة تحت المجهر الفلوري.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. النسبة المئوية للبلعمة للخلايا الزعترية موت الخلايا المبرمج بواسطة الضامة الصفاقية. تم تحفيز الخلايا الزعترية المبرمجة عن طريق الحضانة ب 1 ميكرومتر من staurosporine لمدة 4 ساعات وإضافتها إلى مزرعة البلاعم بنسبة كما هو موضح في لوحات الشكل: (أ) 1: 0 ؛ (ب) 1: 1؛ (ج) 1: 2 ؛ (د) 1: 4 ؛ (ه) 1: 6 ؛ (و) 1: 8 ؛ (ز) 1:10؛ (ح) 1:12. تم الحصول على البيانات باستخدام مقياس التد...

المواد