تقنية للكشف عن السل خارج الرئة عن طريق المجسات النانوية فائقة المغناطيسية

الملخص

المصدر: Lee، C.، et al. توليف وتوصيف وتطبيق مجسات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغناطيسية للكشف عن السل خارج الرئة. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو تقنية للكشف عن السل خارج الرئة. يتم حقن المجسات النانوية لأكسيد الحديد الفائق المغناطيسي (SPIO) ، المقترنة بالأجسام المضادة الخاصة بالمتفطرة ، في فأر مصاب سابقا بالمتفطرة بوفيس BCG ، مما يضع علامة على الورم الحبيبي ويوفر تباينا تصويريا أفضل لاكتشافه.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. توليف SPIO-MtbsAb

1. قم بتصنيع SPIO المترافق 2،2 '- (إيثيلين ديوكسي) ثنائي الأسيثيل أمين (EDBE) باستخدام الطرق التي تم الإبلاغ عنها مسبقا.
2. توليف أنهيدريد SPIO-EDBE-succinic (SA).
   1. حرك محلول قلوي (5 م هيدروكسيد الصوديوم ؛ 10 مل)) من SPIO-EDBE و SA (1 جم ؛ 10 ميكرولتر) في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
   2. غسيل المحلول ب 20 تغييرا بمقدار 2 لتر من الماء المقطر باستخدام أنابيب الغشاء المسامية الجزيئية (قطع 12,000-14,000 ميجاوات). 6 ساعات لكل تغيير.
3. أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من SPIO-EDBE-SA (4 مجم / مل من الحديد) إلى 400 ميكرولتر من 4.5 مجم / مل من الجسم المضاد السطحي للبكتيريا السلية (MtbsAb) لتصنيع SPIO-MtbsAb باستخدام 1-هيدروكسي بنزوتريازول و (بنزوتريازول -1-إيلوكسي) ثلاثي بيروليدينوفوسفونيوم سداسي فلورو فوسفات كمحفزات وحرك المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
4. أخيرا ، افصل المحاليل عن الجسم المضاد غير المرتبط من خلال كروماتوغرافيا ترشيح الترشيح الهلامي.
5. قم بتحميل خليط التفاعل (5 مل) على عمود 2.5 سم × 33 سم وقم بإزالته باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). قم بتأكيد مركب الجسيمات النانوية Ab (أي المسبار النانوي) باستخدام مجموعة فحص بروتين حمض البيسينشونينيك.

< p class = "jove_title" >2. مراقبة مورفولوجيا الجسيمات وقياس طبقة الاسترخاء

1. افحص متوسط حجم الجسيمات ومورفولوجيا وتوزيع الحجم باستخدام مجهر إلكتروني ناقل عند جهد 100 كيلو فولت.
   1. قم بصب التشتت المركب على شبكة نحاسية مكونة من 200 شبكة وجففها في الهواء في درجة حرارة الغرفة قبل تحميلها على المجهر.
2. قم بقياس قيم وقت الاسترخاء (T1 و T2) للمجسات النانوية باستخدام مقياس الاسترخاء بالرنين المغناطيسي النووي عند 20 ميجاهرتز و 37.0 درجة مئوية ± 0.1 درجة مئوية.
   1. معايرة مقياس الاسترخاء قبل كل قياس.
   2. سجل قيم r1 و r2 من نقاط البيانات الثماني التي تم إنشاؤها من خلال الاسترداد الانعكاسي وتسلسل نبضات Carr-Purcell-Meiboom-Gill ، على التوالي ، لتحديد الاسترخاء r1 و r2.

< p class = "jove_title" >3. تصوير الخلايا

1. قم بزراعة الخلايا الوحيدة البشرية THP-1 في RPMI 1640 مع 10٪ مصل بقري للجنين ، و 50 ميكروغرام / مل كبريتات الجنتاميسين ، و 100 وحدة / مل بنسلين G الصوديوم ، و 100 ميكروغرام من كبريتات الستربتومايسين ، و 0.25 ميكروغرام / مل في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية.
2. احتضان المجسات النانوية SPIO-MtbsAb (2 مل) مع 106 وحدة تشكيل مستعمرة (CFU) من المتفطرة بوفيس BCG المحتضنة مسبقا مع 1 × 10⁷ خلايا وحيدة نشطة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (1 مل) في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
3. أنابيب الطرد المركزي عند 200 × جم والتخلص من المادة الطافية. أعد إذابة الكريات في الوسط (200 ميكرولتر).
4. مسح العينات باستخدام تسلسل نبضة صدى متدرج سريع (وقت التكرار (TR) = 500 ؛ وقت الصدى (TE) = 20 ؛ زاوية الوجه = 10 درجات) من خلال التصوير بالرنين المغناطيسي 3.0-T لتحديد خصوصية المسبار النانوي وحساسيته.

4. تلقيح BCG (Bacillus Calmette-Guérin)

1. أعد تكوين اللقاح المجفف بالتجميد أو المخزون البكتيري في وسط ساوتون ثم قم بتخفيف المخزون بالمحلول الملحي حتى يتشتت بشكل صحيح كما هو موضح سابقا.
2. تلقيح سلالة حية موهنة من M. bovis BCG ، تم الحصول عليها من ADIMMUNE (تايبيه ، تايوان) (سلالة Connaught ؛ ImmuCyst Aventis ، Pasteur Mérieux) بحجم 0.1 مل / فأر (أي 10⁷ CFU) داخل الجلد في الجلد الكتفي الظهري الأيسر أو الأيمن للفئران ، كما هو موضح سابقا. حقن المحلول الملحي في الفئران كعنصر تحكم سلبي. مراقبة يوميا بعد تلقيح BCG.
3. التضحية بالحيوانات بعد شهر واحد من تلقيح البكتيريا باستخدام القتل الرحيم لثاني أكسيد الكربون. حصاد الأنسجة من موقع التلقيح داخل الأدمة. قم بتثبيت الأنسجة في 10٪ فورمالين وقم بتضمينها في البارافين للأقسام التسلسلية عند 5-10 ميكرومتر. أقسام الأنسجة الملطخة مع بقع الهيماتوكسيلين / اليوزين و Ziehl-Neelsen للبكتيريا السريعة الحمضية وباللون الأزرق برلين للحديد الحديديك.

< p class = "jove_title" >5. في الجسم الحي التصوير بالرنين المغناطيسي

1. حقن الكيتامين (80 ملغم/كغ من وزن الجسم) والزيلازين (12 ملغم/كغ من وزن الجسم) تحت الجلد في الفئران للتخدير الحيواني.
2. حقن مجسات SPIO-TbsAb (2 نانومول / 200 ميكرولتر) في أوردة ذيل الفئران. الفئران ذات الصور بالرنين المغناطيسي قبل حقن المسبار وبعده مباشرة ثم كل 5 دقائق لمدة 30 دقيقة للحصول على صور صدى دوران سريعة مرجحة T2 (TR = 3000 ؛ TE = 90 ؛ مجال الرؤية = 8).
3. قم بتحليل جميع صور التصوير بالرنين المغناطيسي كميا باستخدام شدة الإشارة (SI) ، وهو قياس لمناطق الاهتمام المحددة في مواقع مماثلة لمركز الورم الحبيبي Mtb والعضلة الخلفية المجاورة لمنطقة الورم الحبيبي.
4. احسب تحسينات الإشارة النسبية باستخدام قياس SI قبل (SIpre؛ التحكم) وبعد 0-3 ساعات من (SIpost) لعوامل التباين باستخدام الصيغة
   [(SIpost - SIpre) / SIpre] × 100
   حيث SIpre هو SIpre للآفة في الفحص المحسن مسبقا و SIpost هو SIpost هو SI للآفة في الفحص اللاحق المحسن.

المواد