اختبار للكشف عن الانفجار التأكسدي في أقراص أوراق نبات الأرابيدوبسيس عند استنباط المناعة

الملخص

المصدر: Bredow، M.، et al. فحوصات تثبيط نمو الشتلات وانفجار الأكسدة التي يسببها النمط في نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا. ج. فيس إكسب. (2019)

يوضح هذا الفيديو فحصا لقياس الانفجار التأكسدي في أوراق نبات الأرابيدوبسيس عند استنباط المناعة. يتم تحضين أقراص الأوراق ، المقطوعة من أوراق النبات ، بالببتيدات البكتيرية التي تعمل كأنماط جزيئية مرتبطة بالميكروبات أو MAMPs. عند اكتشاف MAMPs ، تحفز الخلايا النباتية إنتاج ROS خارج الخلية ، والذي يتم اكتشافه باستخدام مقايسة التلألؤ الكيميائي.

البروتوكول

فئة

1. الكشف عن انفجار أنواع الأنشطة التفاعلية في أقراص أوراق نبات الأرابيدوبسيس بعد الاستنباط المناعي

1. نمو النبات وصيانته.
   1. لمزامنة الإنبات ، قم بتقسيم بذور نبات الأرابيدوبسيس إلى طبقات عن طريق تعليق ما يقرب من 50 بذرة في 1 مل من أجار معقم 0.1٪ [وزن / حجم] وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية (بدون ضوء) لمدة 3-4 أيام.
      ملاحظه: قم بتقسيم عنصر تحكم في الخلفية من النوع البري (على سبيل المثال ، Col-0) والأنماط الجينية ذات المخرجات المناعية العالية والمنخفضة (على سبيل المثال ، cpk28-1 و bak1-5 ، على التوالي) لتكون بمثابة عناصر تحكم داخلية.
   2. زرع البذور على التربة وتنبت في ظل ظروف اليوم القصير القياسية (22 درجة مئوية ، ضوء 10 ساعات ، 150 ميكرو E / م² / ثانية شدة الضوء ، و 65-70٪ رطوبة نسبية).
   3. بعد حوالي 7 أيام ، استخدم الملقط لزرع الشتلات الفردية في أواني جديدة ، مفصولة ب 4 سم على الأقل للسماح بنمو الوردة الكاملة. زرع 6-12 شتلة لكل نمط وراثي والعودة إلى ظروف اليوم القصير القياسية. سقي النباتات وتسميدها بانتظام (1 جم / لتر من 20-20-20 سماد كل أسبوعين).
2. اجمع أقراص الأوراق في 96 طبقا بئرا للتعافي طوال الليل.
   1. في 4-5 أسابيع بعد الإنبات (الشكل 1 أ) ، استخدم ثقب خزعة حاد مقاس 4 مم لإزالة قرص ورقة واحد لكل نبات ، وتجنب منتصف الوريد والحرص على الحد من الجرح (الشكل 1 ب). ضع أقراص الأوراق في صفيحة مقياس الإضاءة 96 بئرا غير مستخدمة تحتوي على 100 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج (ddH₂O) بحيث يكون الجانب المحوري متجها لأعلى لمنع الجفاف (الشكل 1 ج). في حالة تقييم العديد من المحفزات ، قم بإزالة قرص ورقة واحد من نفس الورقة لكل معالجة محرصة.
      ملاحظه: عينة من الأوراق التي تم توسيعها بالكامل ، من الثالث إلى الخامس من أعلى الوردة ، وبنفس الحجم والعمر تقريبا للحد من التباين. إذا أمكن ، قم بقص أقراص الأوراق إلى نصفين باستخدام شفرة حلاقة قبل التعافي طوال الليل ، لأن هذا يزيد من مساحة السطح المعرضة لمحلول المحرص.
   2. استرجع طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لمنع تداخل ROS الناتج عن الجرح أثناء جمع قرص الأوراق. قم بتغطية الألواح بغطاء لمنع التبخر.
3. إجراء معالجة المنشط وقياس إنتاج ROS.
   1. قم ببرمجة قارئ اللوحة قبل إضافة محلول التفاعل ، حيث سيؤدي ذلك إلى تقليل الوقت بين بدء انفجار ROS والقياسات الأولى المسجلة. استخدم برنامجا تجاريا مناسبا لقارئ الألواح. في حالتنا (راجع جدول المحتويات)، انقر فوق إعدادات، وحدد خرطوشة LUM96 ونوع القراءة الحركية. انقر على منطقة القراءة الفئة واسحب لتحديد مجموعة فرعية من الآبار أو اللوحة بأكملها المراد قراءتها. ضمن علامة التبويب PMT والبصريات، اضبط وقت التكامل على 1,000 مللي ثانية. ضمن علامة التبويب التوقيت، اضبط إجمالي وقت التشغيل على 40-60 دقيقة والفاصل الزمني إلى 2 دقيقة.
   2. قم بإزالة الماء من كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.
      ملاحظه: لا تثقب أقراص الأوراق ، لأن ذلك قد يتسبب في إجهاد الجرح ويؤدي إلى المزيد من مخرجات ROS المتغيرة.
   3. قم بإعداد محلول تفاعل يحتوي على 100 ميكرومتر من الألومينول ، و 10 ميكروغرام / مل بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) ، والتركيز المطلوب من المحرض (على سبيل المثال: elf18 عند 1 نانومتر ، أو 10 نانومتر ، أو 100 نانومتر ، أو 1,000 نانومتر) في ddH₂O معقم باستخدام 10 مل من المحلول للوحة واحدة مكونة من 96 بئرا.
      ملاحظه: قم بإذابة الببتيدات المجففة بالتجميد في H₂O المعقمة في أنابيب منخفضة الارتباط لعمل مخزون 10 ملي مولار ، وتجميدها سريعا في السائل N₂ ، وتخزينها في -80 درجة مئوية. عندما تكون جاهزا للاستخدام ، قم بتخفيف المخزون في H₂O معقم لتوليد مخزون عمل 100 ميكرومتر وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
   4. استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 100 ميكرولتر من خليط التفاعل على كل بئر، مع إضافة المحلول إلى جميع أقراص الأوراق من نفس المعالجة في نفس الوقت. قم بتضمين تفاعل تحكم (بدون مستنبذ) لكل نمط وراثي لتقييم مستويات ROS القاعدية في حالة عدم وجود استنباط. قم بقياس انبعاث الضوء على الفور لجميع الأطوال الموجية في الطيف المرئي باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.
      ملاحظه: قم بإعداد وتطبيق محلول التفاعل تحت الإضاءة المنخفضة ، حيث أن اللومينول و HRP عبارة عن كواشف حساسة للضوء. احتفظ بالكواشف على الجليد أو عند -20 درجة مئوية ما لم تكن قيد الاستخدام.
   5. قم بقياس انبعاث الضوء بزمن تكامل يبلغ 1,000 مللي ثانية على فترات 2 دقيقة على مدى 40-60 دقيقة في قارئ صفيحة دقيقة من أجل التقاط الانفجار التأكسدي الديناميكي (الشكل 1D).
      ملاحظه: استخدم وقت تكامل أطول لتحسين حساسية الفحص ، مع التأكد من إمكانية قياس جميع العينات في صفيحة 96 بئرا خلال فترة زمنية واحدة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. اختبار الانفجار التأكسدي القائم على اللومينول بعد الحث المناعي في نبات الأرابيدوبسيس. (أ) زراعة النباتات على التربة في ظروف يوم قصير لمدة 4-5 أسابيع. (ب) استخدم ثقب خزعة 4 مم لجمع أقراص الأوراق من كل نبات والتعافي بين عشية وضحاها في ddH2O. (ج) إضافة محلول التفاعل (100 ميكرومتر من الألومينول ، 10 ميكروغرام / مل HRP ، والتركيز المطلوب من المشتب) وقياس انبعاث الضوء على مدى 4...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 20-20-20 سماد منتج النبات 10529 امزج 1 جم / لتر في الماء وضعه على النباتات كل أسبوعين للحصول على النمو الأمثل. 4 مم خزعة لكمة ميديكال مارت 232-33-34-ف يمكن أيضا استخدام مجموعة حفار الفلين بمساحة سطح 0.125 سم ^ 2. BioHit mLine Mechanical 12 ماصة متعددة القنوات (30-300 ميكرولتر) سارتوريوس 725240 يمكن استخدام أي ماصة متعددة القنوات، وكذلك ماصة واحدة إذا لزم الأمر. قزم 18 (AC-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab [كب7211] قم بتخزين 10 ملي مولار من الببتيد عند -80 درجة مئوية في أنابيب ربط منخفضة البروتين. عند الذوبان ، قم بتخزين 100 ميكرومتر من المخزون العامل عند -20 درجة مئوية. ملقط فيشر ساينتيك 22-327379 بيروكسيداز الفجل سيجما ألدريتش ص 6782 تذوب في الماء النقي. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية وبعيدا عن الضوء. لومينول سيجما ألدريتش أ 8511 يذوب في DMSO. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية وبعيدا عن الضوء. أملاح Murisage و Skoog القاعدية مختبرات Cedarlane MSP09-100LT تخزينها في درجة حرارة 4 درجة مئوية. تربة صن جرو البستنة صن شاين ميكس # 1 يمكن أيضا استخدام أنواع التربة الأخرى لزراعة نبات الأرابيدوبسيس. تخلط بالماء عند ملء الأواني. قارئ Microplate متعدد الأوضاع SpectraMax Paradigm مع وحدة LUM الأجهزة الجزيئية يمكن استخدام أي قارئ لوحة قادر على اكتشاف اللمعان لهذه الفحوصات. ألواح البوليسترين الأبيض 96 بئر فيشر ساينتيك 07-200-589