قياس امتصاص الخلايا الدبقية الصغيرة لجزيئات الفلورسنت التي يتم تسليمها داخل الجسم الزجاجي باستخدام قياس التدفق الخلوي

الملخص

المصدر: Murinello ، S. et al. ، تقييم وظيفة البلعمة الدبقية الدقيقة في الشبكية في الجسم الحي باستخدام الفحص القائم على قياس التدفق الخلوي. J. Vis. Exp.(2016)

يوضح هذا الفيديو قياس التدفق الخلوي لقياس امتصاص الخلايا الدبقية الدقيقة للجسيمات الحيوية الفلورية بعد الولادة داخل الجسم الزجاجي في عين الفأر. يكتشف قياس التدفق الخلوي الخلايا الحية التي تعبر عن CD11b ويميز الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمية التي تظهر مضان أخضر عن الخلايا النخاعية الأخرى ، بما في ذلك الخلايا الوحيدة التي تعبر عن Ly6C والعدلات التي تعبر عن Ly6G.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. تحضير المواد للحقن

1. تعقيم إبرة وحقنة 33 جم: قم بتفكيكها والتعقيم عند 115 ^درجةمئوية. قم بإعداد الإبر للحقن عن طريق الارتفاع في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
2. قم بإذابة الجسيمات المصنفة بالفلورسنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 - 10 دقائق. تحضير محلول الجسيمات للحقن عن طريق إعادة تكوينه إلى محلول 50 مجم / مل في PBS معقم مع أيون الكالسيوم وأيون المغنيسيوم (Ca^{2 +} / Mg²⁺).
   ملاحظه: يتم استخدام الجسيمات ذات الأصل الفطري AF488 والتي تم التحقق من صحتها لمقايسات البلعمة في هذا البروتوكول. للحصول على الامتصاص الأمثل ، قم بإعداد الجزيئات طازجة وقبل الحقن مباشرة. < / > ملاحظة 2: يمكن تحسين تركيزات الجسيمات لكل تجربة محددة.

< p class = "jove_title" >2. الحقن داخل الجسم الزجاجي لمحلول الخرزة

ملاحظة: مطلوب شخصين لإجراء الحقن ، بطريقة تجعل الشخص الذي يقوم بالحقن يمكنه حمل الماوس والحفاظ على التركيز على مقلة العين ، بينما يمرر الشخص الآخر المحقنة المحملة ويدفع المكبس.

1. تخدير القوارض عن طريق الحقن داخل الصفاق بمقدار 100 مجم / مل من الكيتامين و 10 مجم / مل زيلازين بجرعة 20 ميكرولتر / 10 جم من وزن الجسم. قبل الحقن ، استخدم قرصة إصبع القدم لتقييم مستوى التخدير.
   ملاحظه: إيزوفلوران له تأثير عميق على وظيفة الخلايا النخاعية ، وبالتالي ، يجب تجنب استخدامه في جميع أنحاء هذا الفحص.
2. قم بتحميل الإبرة ب 0.5 ميكرولتر من محلول الجسيمات المسمى بالفلورسنت.
3. ضع الفأر جانبا تحت المجهر الجراحي (الشكل 1 أ-ب). استخدم مادة ناعمة ، على سبيل المثال ، عبوة هلام ، لتحسين وضع الماوس. بالنسبة للفئران الصغيرة التي لم تفتح فيها العيون بعد ، افتح الجفون برفق بمساعدة ملقط^بزاوية 45 درجة عن طريق إنشاء شق على طول الشق الذي ستفتح منه الجفون في النهاية.
   1. بمساعدة ملقط بزاوية 45^درجة ، قم بالضغط بعناية حول الجفن ، بحيث تنبثق مقلة العين قليلا من التجويف. امسك الرأس بإصبعين فوق الأذن والفك مباشرة وقم بتمديد الجلد برفق بالتوازي مع الجفون لإبعاد العين قليلا عن التجويف. احرص على عدم الإمساك بالقرب من الحلق (الشكل 1 ب).
4. لثقب مقلة العين ، أدخل إبرة المحقنة في طيفي القرنية (حيث تتصل القرنية والصلبة). يظهر هذا على شكل دائرة رمادية في الفئران المصطبغة. اسحب الإبرة قليلا لطرد كمية صغيرة من السائل الزجاجي ثم حقنها. يجب على الشخص الذي يقوم بالحقن أن يمسك بلطف الماوس بيد واحدة والإبرة باليد الأخرى ؛ يجب على الشخص الثاني دفع المكبس ببطء.
5. اسحب المحقنة ببطء. ضعي قطرات ترطيب العين للحفاظ على ترطيب العين.
6. دع القوارض تتعافى في قفص فوق وسادة حرارية واستمر في مراقبة. إذا كنت تعمل مع الجراء ، فلا تعيد إلى قفص مع أخرى في حالة تأهب حتى يتنفس وقادر على الحركة التلقائية. إذا كنت تعمل مع البالغين ، فلا تعيد القوارض إلى قفص مع أخرى في حالة تأهب حتى تستعيد الرق القصي.

< p class = "jove_title" >3. حصاد أنسجة الشبكية

ملاحظة: يجب جمع أنسجة الشبكية من العين غير المحقونة بجزيئات مصنفة بالفلورسنت كعنصر تحكم لتحليل قياس التدفق الخلوي. على الرغم من أنه يمكن إجراء الفحص باستخدام شبكية واحدة ، للحصول على أفضل أداء ، يجب تجميع شبكية العين معا.

1. اجمع أنسجة الشبكية بعد 3 ساعات من الحقن داخل الجسم الزجاجي للجزيئات المصنفة بالفلورسنت.
   ملاحظه: في حين أن الوقت التالي لحقن محلول الجسيمات قد يكون محسنا لكل تجربة محددة ، وجدنا أنه بعد 3 ساعات من الحقن ، يمكن رؤية امتصاص الجسيمات في معظم طبقات شبكية العين (الشكل 1C-D).
2. التضحية بالفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
3. اجمع مقل العيون عن طريق الضغط برفق على الجفن بمساعدة ملقط بزاوية 45^درجة لتحفيز مقلة العين. ضع الملقط خلف مقلة العين واسحبه.
4. تشريح شبكية العين تحت مجهر تشريح. انقل مقلة العين إلى طبق بتري يحتوي على كمية صغيرة من PBS مع Ca^{2 +} / Mg²⁺. في منطقة جافة من طبق بتري ، قم بثقب مقلة العين في أطراف القرنية بطرف ملقط فائق النعومة.
5. امسك مقلة العين بمساعدة ملقط بزاوية 45^درجة واستخدم مقص زنبركي لقطع حول طيفي القرنية ، حتى يتم قطع ما يقرب من نصف محيط القرنية.
6. امسك مقلة العين بالملقط الناعم بزاوية 45^درجة وجلب مقلة العين إلى PBS. مع زوج ثان من الملقط الناعم بزاوية 45^درجة ، قم بتمزيق القرنية والصلبة. ستخرج العدسة وشبكية العين سليمة.
7. افصل العدسة عن شبكية العين. اجمع شبكية العين وانقلها إلى أنبوب اختبار البوليسترين سعة 5.4 مل يحتوي على 2 مل من PBS مع Ca^{2 +} / Mg²⁺.

< p class = "jove_title" >4. تحضير تعليق خلية واحدة

1. قم بإعداد معلقات أحادية الخلية باستخدام مجموعة تفكك الأنسجة العصبية مع تعديلات طفيفة على تعليمات الشركة المصنعة. باختصار، قم بعمل ثلاثية الشبكية عن طريق سحب العين لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000 وإجراء عملية هضم إنزيمي عند 37 ^درجةمئوية دون اهتزاز.

< p class = "jove_title" >5. تلطيخ معلقات الخلية المفردة لتحليل قياس التدفق الخلوي

1. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من محلول التلوين (محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco مع 0.2٪ ألبومين مصل بقري (BSA) و 0.09٪ أزيد الصوديوم) ونقلها إلى صفيحة U-bottom 96 بئر. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 130 × جم
   ملاحظه: أزيد الصوديوم ضار بالبشر والبيئة. استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة وتخلص من النفايات وفقا للوائح المحلية.
2. اقلب اللوحة فوق الحوض للتخلص من المادة الطافية. لمنع مستقبلات Fc ، أعد تعليق الخلايا في 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للبقع الذي يحتوي على 5 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد CD16 / CD32 المضاد للفأر لكل بئر. احتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ يحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل من Ly6C-APC-Cy7 المضاد للفأر ، و 0.5 ميكروغرام / مل من Ly6G-Pe-Cy7 المضاد للفأر ، و 2.5 ميكروغرام / مل من CD11b-BV650 المضاد للفأر. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
4. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 130 × جم. اقلب اللوحة للتخلص من المادة الطافية. يغسل عن طريق تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من محلول التلوين.
5. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 130 × جم. يعاد تعليقه في 200 ميكرولتر من محلول البقع الذي يحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل من يوديد البروبيديوم (PI). نقل إلى أنابيب ميكروتيتر 1.2 مل.
6. اغسل الآبار ب 100 ميكرولتر إضافية من محلول التلوين الذي يحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل من PI وتجمع مع 200 ميكرولتر سابقة في أنابيب الميكروتيتر سعة 1.2 مل. يتم الحصول على حجم إجمالي قدره 300 ميكرولتر من الخلايا الملطخة.

فئة

6. تحليل التدفق الخلوي

1. باستخدام ثلاثة ليزر تقليدية (ليزر بنفسجي وأزرق وأحمر) ، تجنب أصباغ PE و PerCP-Cy5.5 و BV510 و PI بسبب الامتداد الكبير من جسيمات AF488 الفلورية الساطعة للغاية. استخدم ليزر رابع (أصفر) لتحسين هذا الاختبار ، لأنه يسمح باستخدام الأجسام المضادة المسماة ب PE و PI (في قناة mCherry بدلا من قناة PerCP-Cy5.5) (الشكل 2).
   ملاحظه: إذا لم يكن الليزر الأصفر متاحا ، فاستخدم صبغة استبعاد الخلايا الميتة في قناة أخرى.
2. بوابة على الخلايا السالبة PI (PI-) لاستبعاد الخلايا الميتة (الشكل 2 ب).
3. بعد استبعاد الخلايا الميتة ، قم ببوابة الخلايا الموجبة CD11b (CD11b ⁺) ، وسيشمل ذلك جميع الخلايا النخاعية (الشكل 2C).
4. ضمن مجموعة CD11b ⁺ ، بوابة على Ly6C^- / Ly6G^- لاستبعاد العدلات (CD11b ⁺ / Ly6G ⁺) والخلايا الوحيدة (CD11b ⁺ / Ly6C ⁺ ؛ الشكل 2 د). بعد البوابات على الخلايا الدبقية الصغيرة (المعرفة هنا على أنها CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G^- للتبسيط) ، يجب أن تكون مجموعات سكانية واضحة مرئية ؛ واحد سلبي والآخر إيجابي للجسيمات المصنفة بالفلورسنت. سوف تكون الخلايا البلعمية قد امتصت الجسيمات وبالتالي فهي AF488⁺ (الشكل 2E).
   ملاحظه: يمكن أيضا تحليل المجموعات الإيجابية ل Ly6C أو إيجابية Ly6G لقياس امتصاص الجسيمات باستخدام نهج التلوين هذا. ترتبط النسبة المئوية لخلايا CD11b ⁺ البلعمية بشكل جيد مع النسبة المئوية للخلايا الدبقية الصغيرة البلعمية (الشكل 2F). بالنسبة للباحثين الذين ليس لديهم خبرة في قياس التدفق الخلوي ، يمكن إجراء تحليل أبسط باستخدام تلطيخ CD11b وحده ، وإن كان ذلك سيشمل العدلات البلعمية والخلايا الوحيدة ، بالإضافة إلى الخلايا الدبقية الصغيرة. ضمن هذه المجموعة CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G^- ، > هذه الخلايا الدبقية الصغيرة بنسبة 99٪ كما يتم الحكم عليها عن طريق التلوين بعلامات F4 / 80 و CX3CR1 ؛ يمكن إضافة هذه العلامات ولكنها ليست ضرورية في أيدينا.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: إعداد الحقن داخل الجسم الزجاجي وقسم الشبكية التمثيلي الذي يظهر الجسيمات المصنفة بالفلورسنت في طبقات الشبكية. (أ)يتم وضع عبوة هلامية تحت مجهر التشريح. (ب) يتم وضع القوارض كما هو موضح لوضع العين للحقن داخل الجسم الزجاجي. (ج) بعد ثلاث ساعات من الحقن ، يمكن رؤية الجسيمات ذات العلامات الفلورية في معظم طبقات الشبكية. (D ، E)

المواد