إنتاج الأجسام المضادة من ثقافة فرط النمو الدفعي لخلايا الثدييات المنقولة

الملخص

المصدر: Elgundi، Z. et al.، إنتاج وتنقية الجسم المضاد العلاجي على نطاق المختبر.J. Vis. Exp.(2017)

يوضح الفيديو طريقة لإنتاج أجسام مضادة علاجية باستخدام خلايا الثدييات المنقولة بثبات. تحفز مكملات التربتون انقسام الخلايا ، مما يؤدي إلى فرط النمو ودعم إنتاجية أعلى للأجسام المضادة. يتم حصاد الوسط المحتوي على الجسم المضاد وتصفيته وتخزينه لاستخدامه مرة أخرى.

البروتوكول

ملاحظة: يجب استخدام متجه تعبير ثديي مناسب لهذا البروتوكول. هنا ، يتم استخدام بنية واحدة تحتوي على كاسيتين تعبيريين (على سبيل المثال ، يتم تشغيل تعبير السلسلة الثقيلة والخفيفة بواسطة مروجين منفصلين). تم استنساخ سلاسل Trastuzumab الثقيلة والخفيفة سابقا في الناقل. كان هذا المتجه هدية من أندرو بيفيل ، تم الحصول عليها من خلال مستودع بلازميد غير هادف للربح.

1. استعادة وتوسيع نطاق الحمض النووي المتجه

ملاحظة: تم تلقي الحمض النووي المتجه كثقافة طعنة أجار ناعمة في الإشريكية القولونية XL-1 سلالة زرقاء ؛ ناقل يحمل مقاومة الهيغروميسين.

1. أدخل طعنة أو حلقة تلقيح معقمة في الأجار الناعم لمزرعة الطعن ، ثم قم بوضع صفيحة أجار لوريا بيرتاني (LB) المحضرة ب 75 ميكروغرام / مل هيجروميسين للمستعمرات المعزولة. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة.
2. تلقيح مستعمرة واحدة في 5 مل مرق رائع (TB) يحتوي على 75 ميكروغرام / مل هيجروميسين. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة مع الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة.
3. استخدم المزرعة الليلية لتحضير مخزون الجلسرين من الحمض النووي الناقل عن طريق خلط 800 ميكرولتر من المزرعة برفق مع 200 ميكرولتر 80٪ جلسرين في التبريد والتجميد عند -80 درجة مئوية.
   1. أضف 100 ميكرولتر من المزرعة الليلية إلى 100 مل تيرابايت تحتوي على 75 ميكروغرام / مل هيغروميسين في قارورة شاكر محيرة (أي 1/1,000 مخفف). احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة مع اهتزاز 225 دورة في الدقيقة.
4. بعد الاستزراع بين عشية وضحاها ، قم باستخراج وتنقية الحمض النووي منقوص الأكسجين (DNA) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمجموعة تحضير midi / maxi مع الاستثناء التالي ؛ خلال الخطوة الأخيرة ، قم بتصفية أو تعليق الحمض النووي بالماء (الرقم الهيدروجيني 7.0-8.5).
5. تحقق من تركيز ونقاء الحمض النووي عن طريق قراءات الامتصاص عند 260 و 280 نانومتر ، ثم قم بتخزين الحمض النووي عند -20 درجة مئوية.
   ملاحظة: اختياري (موصى به بشدة): تسلسل الحمض النووي باستخدام بادئات خاصة بالمتجهات لتأكيد الهوية.

< p class = "jove_title" >2. تعداء مستقر لخلايا HEK-293

1. قم بتنمية خلايا HEK-293 (الخلايا المعلقة) والحفاظ عليها وفقا للبروتوكولات القياسية في الوسائط الخالية من المصل المكملة ب 0.1٪ خافض للتوتر السطحي غير أيوني في قوارير Erlenmeyer. الحفاظ على 2 × 10⁵ خلايا / مل والزراعة الفرعية كل أربعة أيام. خلايا المزروعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂) ودوران 120 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا في المزرعة لمدة لا تقل عن 4 أيام ولا تزيد عن 4 أسابيع قبل التعدي. يمكن أيضا استخدام خلايا HEK-293 المزروعة كطبقات أحادية في وسائط تحتوي على مصل في هذا الإجراء.
2. في اليوم السابق للتعدي ، قم ببذور خلايا HEK-293 عند 3 × 10⁵ خلايا / مل في آبار صفيحة مكونة من 12 بئرا في 2 مل من Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) مكملة بمصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 10٪ (FBS). في يوم التعدي ، تحقق من وصول الخلايا إلى 80-90٪ من التقاء
قم
3. بتخفيف الحمض النووي والبولي إيثيلينيمين (PEI) بشكل منفصل في وسط التعداء ثم امزجهما معا.
   1. قم بتخفيف 1.25 ميكروغرام من الحمض النووي المتجه لكل بئر (15 ميكروغرام لكل 12 بئرا) في وسائط تعداء 300 ميكرولتر. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   2. تمييع 2.5 ميكرولتر من محلول 1 مجم / مل PEI (30 ميكرولتر ل 12 بئرا ، أي نسبة 1: 2 من الحمض النووي إلى PEI) في وسائط تعداء 300 ميكرولتر. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   3. أضف الحمض النووي المخفف إلى PEI المخفف ، واخلطه برفق واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
4. أضف 50 ميكرولتر من خليط الحمض النووي / جزيرة الأمير إدوارد بالتنقيط إلى كل بئر من اللوحة. هز اللوحة برفق لتوزيع خليط التعدي ، ثم ضع اللوحة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة.
5. أضف 50 ميكروغرام / مل hygromycin B لكل بئر وأعد الطبق إلى 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} لمدة 10 أيام.
   ملاحظة: بحلول اليوم العاشر ، تكون الخلايا غير المنقولة قد ماتت وانفصلت عن سطح الصفيحة ، في حين أن الخلايا التي تم نقلها بثبات ستكون قابلة للحياة ومتصلة باللوحة.
6. يستبدل الوسائط الموجودة في الآبار بوسائط خالية من المصل بحجم 1/4 و3/4 حجم DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS (أي 0.5 مل من الوسائط الخالية من المصل + 1.5 مل DMEM = 7.5٪ تركيز نهائي للمصل) واحتضانها لمدة 4 أيام.
7. استبدال الوسائط في الآبار بوسائط خالية من المصل بحجم 1/2 و 1/2 حجم DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS (أي 1 مل من الوسائط الخالية من المصل + 1 مل DMEM = تركيز المصل النهائي 5٪) واحتضانها لمدة 4 أيام.
8. يستبدل الوسائط الموجودة في الآبار ب 3/4 وسائط خالية من المصل و 1/4 حجم DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS (أي 1.5 مل من الوسائط الخالية من المصل + 0.5 مل DMEM = 2.5٪ تركيز المصل النهائي) واحتضانها لمدة 4 أيام.
9. استبدل الوسائط في الآبار ب 2 مل من الوسائط الخالية من المصل المكملة بمحلول خافض للتوتر السطحي غير أيوني بنسبة 0.1٪ (أي تركيز مصل نهائي 0٪) واحتضنه لمدة 4 أيام.
   ملاحظة: حافظ على ضغط انتقائي 50 ميكروغرام / مل هيجروميسين ب على الخلايا أثناء التكيف الخالي من المصل. تنفصل الخلايا التي تتكيف مع الوسائط الخالية من المصل عن سطح الآبار وقد تتجمع في حالة تعليق. يرجى الرجوع إلى الخطوة 2.1 للاطلاع على ظروف الاستزراع مع المكمل الإضافي البالغ 50 ميكروغرام/مل من الهيغروميسين B.
10. باستخدام ماصة ، امزج بلطف مزارع التعليق في الصفيحة المكونة من 12 بئرا وخلايا البركة في أنبوب منفصل.
    1. باستخدام مقياس كثافة الدم ، قم بتعداد الخلايا والبذور المجمعة في وسائط خالية من المصل سعة 30 مل في قارورة Erlenmeyer بمعدل 2 × 10⁵ خلايا / مل ، وخلايا المزروعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ و 120 دورة في الدقيقة. الثقافة الفرعية والتوسع كل أربعة أيام.
11. استمر في توسيع حجم المزرعة إلى كثافة الخلية المطلوبة للحصول على 10 قوارير عند 1 × 10⁷ خلايا / قارورة للحفظ بالتبريد في النيتروجين السائل. قم بتجميد الخلايا في وسائط خالية من المصل تحتوي على 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
    ملاحظة: يمكن حصاد الوسائط المكيفة التي تحتوي على أجسام مضادة في كل مزرعة فرعية لتأكيد إنتاج البروتين أو استخدامها لتحسين ظروف التنقية. لحصاد الوسائط المكيفة والحفاظ على الخلايا للزراعة الفرعية ، قم بالطرد المركزي للثقافة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. يمكن الاحتفاظ بالمادة الطافية المفلترة عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أسابيع أو -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

فئة

3. إنتاج الأجسام المضادة على نطاق واسع من ثقافة Batch Overgrow

ملاحظة: يمكن متابعة إنتاج الأجسام المضادة من الخطوة 2.11 ، حيث يتم توسيع الخلايا الموجودة إلى كثافة الخلية المطلوبة بناء على حجم مزرعة الدفعة المراد إعدادها. خلاف ذلك ، تبدأ الخلايا التي تم إذابتها من الحفظ بالتبريد في هذه المرحلة بمجرد توسيعها إلى كثافة وحجم خلية مناسبين. يمكن استخدام مكملات استزراعية مختلفة لتحسين إنتاج الأجسام المضادة. يتم توضيح استخدام التربتون لزيادة إنتاجية الأجسام المضادة في هذا البروتوكول.

1. خلايا البذور في 2 × 10⁵ خلايا / مل في وسائط خالية من المصل 100 مل في قارورتين من Erlenmeyer (لمقارنة غلة الأجسام المضادة من الثقافات غير المكملة والمكملة بالمغذيات). الاستزراع عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ و 120 دورة في الدقيقة.
2. بعد 24 ساعة، أضف التربتون إلى تركيز نهائي قدره 0.5٪ إلى المزرعة المكملة بالمغذيات. معادلة حجم المزرعة غير المكملة بوسائط خالية من المصل.
3. من اليوم 8 ، قم بإجراء تعداد خلايا الثقافات يوميا باستخدام مقياس الدم لمراقبة صلاحية الخلية. حصاد المواد الطافية المزرعة بمجرد أن تكون صلاحية الخلية أقل من 80٪.
   1. حصاد المادة الطافية عن طريق الطرد المركزي للمزارع عند 3,000 × جم لمدة 15 دقيقة ، ثم قم بتصفية المادة الطافية (التي تحتوي على جسم مضاد) من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. قم بتخزين المواد الطافية في درجة حرارة 4 درجات مئوية (على المدى القصير) أو قم بتجميدها عند -20 درجة مئوية (على المدى الطويل).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات سلسلة ناقلات pFUSE غير متاح إنفيفوجين جينات الأجسام المضادة الثقيلة والخفيفة المعبر عنها في نواقل منفصلة تتطلب تعداء مشتركا. سلسلة ناقلات mAbXpress غير متاح أسيت للتكنولوجيا الحيوية المحدودة جينات الأجسام المضادة الثقيلة والخفيفة المعبر عنها في نواقل منفصلة تتطلب تعداء مشتركا. الرجوع إلى: جونز ، إم إل وآخرون. طريقة لإعادة التنسيق السريع والمستقل عن الربط للأجسام المضادة أحادية النسيلة المؤتلفة. طرق J المناعية. 354 (1-2) ، 85-90 ، doi: 10.1016 / j.jim.2010.02.001 ، (2010). متجه pVITRO1 غير متاح غير متاح يتم تشغيل جينات الأجسام المضادة الثقيلة والخفيفة بواسطة محفز منفصل في ناقل واحد. الرجوع إلى: Dodev ، T. S. et al. مجموعة أدوات للاستنساخ السريع والتعبير عن الأجسام المضادة المؤتلفة. ممثل العلوم 4 5885 ، دوي: 10.1038 / srep05885 ، (2014). سلسلة ناقلات GS غير متاح لونزا ناقل متعدد السيسترونيك مع جينات الأجسام المضادة الثقيلة والخفيفة يتم التعبير عنها وترجمتها كنسخة واحدة. سلسلة ناقلات متعددة السترونيك 1 غير متاح غير متاح ناقل متعدد السيسترونيك مع جينات الأجسام المضادة الثقيلة والخفيفة يتم التعبير عنها وترجمتها كنسخة واحدة. راجع إلى: Li, J. et al. دراسة مقارنة لتصاميم النواقل المختلفة للتعبير الثديي عن الأجسام المضادة IgG المؤتلفة. طرق J المناعية. 318 (1-2) ، 113-124 ، doi: 10.1016 / j.jim.2006.10.010 ، (2007). سلسلة ناقلات متعددة السترونيك 2 غير متاح غير متاح ناقل متعدد السيسترونيك مع جينات الأجسام المضادة الثقيلة والخفيفة يتم التعبير عنها وترجمتها كنسخة واحدة. الرجوع إلى: Ho، S. C. et al. ناقلات التريكسترونيك بوساطة IRES لتعزيز توليد الأجسام المضادة أحادية النسيلة العالية التي تعبر عن خطوط خلايا CHO. ي Biotechnol. 157 (1) ، 130-139 ، doi: 10.1016 / j.jbiotec.2011.09.023 ، (2012). pVITRO1-Trastuzumab-IgG1 / κ 61883 أدجين ناقلات التعبير للثدييات التي تحتوي على جينات الأجسام المضادة trastuzumab مع جين مقاومة hygromycin ؛ pVITRO1-Trastuzumab-IgG1 / κ كانت هدية من أندرو بيفيل. الوسائط السريعة Hygro Agar فاس - زئبق - ق جومار لايف ريسيرش يستخدم لتحضير أجار LB منخفض الملح يحتوي على 75 ميكروغرام / مل هيغروميسين. الوسائط السريعة Hygro TB FAS-HG-L جومار لايف ريسيرش يستخدم لتحضير مرق السل قليل الملح الذي يحتوي على 75 ميكروغرام / مل هيغرومايسين. الجلسرين ، BioXtra ، ≥99٪ جي 6279 سيجما ألدريتش استعد بنسبة 80٪ بالماء والأوتوكلاف. يحفظ في درجة حرارة الغرفة. جيستار 2.0 / LFU بلازميد ماكسي كيت G221020 علم نجمي مجموعة البلازميد ماكسي الإعدادية ؛ قم بإزالة أو تعليق الحمض النووي في الماء (الرقم الهيدروجيني 7.0-8.5). خلايا فري ستايل 293-F R790-07 تقنيات الحياة خط خلايا HEK-293 يتكيف مع ثقافة التعليق في الوسائط الخالية من المصل. فري ستايل 293 تعبير متوسط هاتف: 12338-018 تقنيات الحياة وسائط خالية من المصل مصممة خصيصا للحفاظ على خط خلايا 293-F والتعبير العالي عن البروتين. كوليفور P188 ك 4894 سيجما ألدريتش خافض للتوتر السطحي غير أيوني ؛ المتعدد F-68 ؛ يستعد بنسبة 10٪ في الماء وتعقيم الترشيح باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. DMEM، ارتفاع نسبة الجلوكوز 11995-065 تقنيات الحياة مصل الأبقار الجنينية المعطلة بالحرارة 10082-147 تقنيات الحياة بولي إيثيلينيمين، خطي، ميغاواط 25,000 هاتف: 23966 Polysciences، Inc. استعد إلى 1 مجم / مل في الماء. اضبط على درجة الحموضة 7.0 باستخدام 1 M HCl (يصبح المحلول واضحا) وقم بتعقيمه باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. الطراز OptiPro SFM 12309-050 تقنيات الحياة الوسائط الخالية من المصل المصنوعة من التعداء محلول هيجروميسين ب النمل زئبق -1 جومار لايف ريسيرش ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) AJA2225 ثيرمو فيشر العلمي التربتون (الكازين بيبتون) LP0042B ثيرمو فيشر العلمي استعد إلى 20٪ في PBS وقم بتعقيمها باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. نظام BLItz 45-5000 فورتيبيو أداة تستخدم لقياسات قياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI).