تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. مجموعة من الكريات البرازية الطازجة
- قم بإعداد مناشف ورقية معقمة ، ملقط غير حاد ، وأنابيب مخروطية سعة 50 مل.
- ضع بعض المناشف الورقية والملقط في أكياس أوتوكلاف منفصلة وقم بالتعقيم على حرارة 180 درجة مئوية في حرارة جافة لمدة 30 دقيقة. قم بوزن الأنابيب المخروطية واكتب وزنها على الأنابيب.
- قم بتشغيل خزانة السلامة الحيوية في غرفة.
- خذ قفص فأر نظيف معقم بدون أي فراش وضعه في خزانة السلامة الحيوية. قم بإزالة الغطاء ورف الطعام وضعهما داخل الخزانة.
- ضع بعض المناشف الورقية المعقمة في قاع القفص وضع الرف المعدني مرة أخرى فوق القفص.
- حدد المتبرعين بالبراز المطابقين للعمر وضع قفص الفأر في خزانة السلامة البيولوجية. افتح القفص وامسك بفأر مانح برفق (C57BL / 6J) من الذيل وضعه على الرف المعدني أعلى القفص النظيف.
- ضع غطاء القفص أعلى الرف وانتظر حتى يتغوط ().
ملاحظة: ضع عددا قليلا من رفقاء الفأر على الرف في وقت واحد.
- اجمع الكريات البرازية وضعها في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. تجمع الكريات حسب الجنس. لا تخلط حبيبات البراز التي تم جمعها من الذكور والإناث.
- قم بوزن الأنبوب مرة أخرى واحسب وزن الكريات البرازية.
< p class = "jove_title" >
2. تحضير تعليق البراز
- تحضير محلول معقم (10٪ جلسرين في محلول ملحي عادي).
- أضف 10 مل من الجلسرين بنسبة 10٪ / محلول ملحي عادي إلى الأنبوب المخروطي لكل جرام من الكريات البرازية.
ملاحظة: قم بزيادة حجم المحلول إلى 20 مل إذا لزم الأمر. استخدمت هذه الدراسة 1 مل من المحلول لكل حبيبات (5-10 مجم) أيضا.
- قم بتجانس الخليط بسرعة منخفضة باستخدام الخالط أو الخلاط داخل غطاء الدخان لإعادة تعليق البراز (3 × 30 ثانية).
- قم بتصفية معلق البراز من خلال طبقتين من شاش قطني معقم (10.2 سم × 10.2 سم). قم بتخزين المرشح مؤقتا في الثلاجة لمدة تصل إلى 6 ساعات أو قم بتعبئته في قوارير معقمة مبردة وقم بتخزينه في فريزر -80 درجة مئوية.
- قم بتنظيف الخالط أو الخلاط جيدا باتباع الإجراء القياسي.
< p class = "jove_title" >
3. إعطاء تعليق البراز عن طريق التزقيم الفموي
- قم بإذابة معلق البراز المجمد على الثلج إذا كنت تستخدم عينات مجمدة. امزج معلق البراز المذاب عن طريق الدوامة.
- انقل معلق البراز الطازج أو المذاب إلى محاقن سعة 1 مل.
ملاحظة: سيحصل كل فأر على ما مجموعه 200 ميكرولتر من تعليق البراز ، وسيحصل كل فأر IL-10 في المجموعة الضابطة على 200 ميكرولتر من 10٪ جلسرين / محلول ملحي عادي.
- قم بوزن الفئران واختر حجم إبرة التزقيم المناسب والحد الأقصى لحجم الجرعة.
ملاحظة: بالنسبة للفئران التي يتراوح وزنها بين 20-25 جراما ، استخدم إبرة تزقيم منحنية 20 جم 3.81 سم مع كرة 2.25 مم. يرجى التحقق من gavageneedle.com لمزيد من المعلومات.
- اختبر إبرة التزقيم عن طريق قياس الطول من طرف أنف الفأر إلى عملية الخنجري (أسفل القص). املأ المحقنة بنسبة 10٪ جلسرين / محلول ملحي أو تعليق براز وقم بإزالة فقاعات الهواء داخل المحقنة والإبرة. < / >
ملاحظة: إذا كانت الإبرة أطول من الطول ، فضع علامة على عمود الإبرة / الأنبوب على مستوى الأنف. لا تمرر الإبرة / الأنبوب عبر بعد تلك النقطة لمنع ثقب المعدة.
- ضع قفصا واحدا من الفأر في خزانة السلامة الحيوية ، وقم بإزالة غطاء القفص البلاستيكي ، واترك الرف المعدني في مكانه.
- أمسك فأرا واحدا من الذيل وضعه على الرف المعدني. أمسك الماوس من الذيل بيد واحدة واستخدم الإبهام والأصابع الوسطى من يد أخرى لكبح جماح عن طريق الإمساك بالجلد على الكتفين. بهذه الطريقة ، يتم تمديد الأرجل الأمامية إلى الجانب ، مما يمنع القدمين الأماميتين من دفع الإبرة للخارج. مد رأس برفق للخلف وامسك الرأس في مكانه بيد واحدة. < / >
ملاحظة: تدرب على التعامل مع الماوس حتى يحصل المجرب على الثقة الكاملة قبل الشروع في التجربة.
- ضع إبرة التزقيم أعلى اللسان داخل الفم. تقدم برفق على طول الحنك العلوي حتى تصل الإبرة إلى المريء. مرر الإبرة بسلاسة في حركة واحدة. لا تضغط على الإبرة إذا شعرت بأي مقاومة. أخرج الإبرة وحاول مرة أخرى.
- بمجرد وضع الإبرة والتحقق منها بشكل صحيح ، قم بإدارة المادة ببطء عن طريق دفع المحقنة المتصلة بالإبرة. لا تقم بتدوير الإبرة أو دفع الإبرة للأمام ، مما قد يؤدي إلى تمزق المريء. بعد الجرعات ، اسحب الإبرة برفق للخارج.
- أعد الماوس إلى قفص منزله. راقب لمدة 5-10 دقائق من خلال البحث عن علامات صعوبة التنفس أو الضيق. راقب الفئران مرة أخرى بين 12-24 ساعة بعد FMT.
