تقنية لزراعة الخلايا العصبية في الحصين الفأر

الملخص

المصدر: Yang، R.، et al. استخدام الخلايا العصبية الأولية للحصين المزروعة لدراسة تجميع الأجزاء الأولية للمحور العصبي. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح الفيديو طريقة لزراعة الخلايا العصبية من الحصين الفئراني. في البداية ، يخضع الحصين للهضم الأنزيمي لتحطيم مصفوفة الأنسجة خارج الخلية. بعد ذلك ، يتم تعطيل الأنسجة المهضومة ميكانيكيا لعزل الخلايا العصبية الفردية. أخيرا ، يتم زراعة هذه الخلايا العصبية على الخلايا المغذية الدبقية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير أطباق تغذية الخلايا الدبقية (2 قبل أسبوعين من يوم الثقافة)

1. قم بتشريح القشرة من دماغ فأر بعد الولادة يبلغ من العمر يوم واحد وقم بإزالة السحايا.
2. اقطع أنسجة القشرة ناعما قدر الإمكان بمقص نظيف في طبق بتري نظيف على مقعد نظيف.
3. انقل الأنسجة المفرومة إلى 12 مل من HBSS وأضف 1.5 مل من 2.5٪ تربسين و 1٪ (بالوزن / حجم) DNase. احتضن في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، مع التأرجح كل 5 دقائق. تصبح الأنسجة المهضومة جيدا لزجة وتشكل مجموعة كبيرة. قم بترتيبوت 10-15 مرة باستخدام ماصة سعة 10 مل لتفتيت الأنسجة والحصول على عملية هضم أفضل.
4. قم بتقطيع الأنسجة المهضومة جيدا 10-15 مرة باستخدام ماصة سعة 5 مل حتى تختفي معظم القطع ويصبح الوسط غائما. مرر عبر مصفاة خلوية لإزالة القطع المتبقية وأضف 15 مل من الوسط الدبقي (الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) مكمل بالجلوكوز (0.6٪ بالوزن / الحجم) ، و 10٪ (حجم / حجم) مصل الحصان ، والبنسلين ستربتومايسين (1x) لوقف الهضم.
5. الطرد المركزي للخلايا عند 120 × جم لمدة 5 دقائق وشفط المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية بوسط الخلايا الدبقية الطازجة والبذور في أطباق زراعة الخلايا (حوالي 10⁵ خلايا / سم²).
6. استبدل الوسط بوسط دبقية طازج في اليوم التالي لإزالة الخلايا غير المتصلة.
7. قم بإطعام أطباق الدبقية كل 3-4 أيام بوسط دليبيا الطازج. صفع القارورة 5-10 مرات بيد لإخراج الخلايا المرتبطة بشكل فضفاض قبل تغيير الوسط.
8. بعد 10 أيام من الثقافة ، يجب أن تكون الخلايا الدبقية متقاربة تقريبا. افصل الخلايا الدبقية التي تحتوي على 0.25٪ تريبسين-EDTA وزرع حوالي 10⁵ خلايا في طبق ثقافة خلية جديد مقاس 60 مم. يمكن تجميد الخلايا المتبقية لاستخدامها في المستقبل.
9. قبل 3 أيام من يوم المزرعة ، قم بتغيير وسط الخلايا الدبقية إلى وسط الثقافة العصبية (Neurobasal-A Medium مع 1x GlutaMAX-I و 1x B27 الملحق)

< p class = "jove_title" >2. ثقافة الخلايا العصبية الحصين

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة.

1. قم بتشريح 6-8 حصين من الجراء بعد الولادة البالغة من العمر يوم واحد من الفئران ANK3-E22 / 23f / f مع متوسط HBSS في طبق بتري في درجة حرارة الغرفة. يقطع الحصين بمقص التشريح إلى قطع أصغر. انقل الحصين من طبق بتري إلى أنبوب سعة 15 مل.
2. اغسل الحصين 2x مع 5 مل من HBSS في الأنبوب. اترك الحصين في 4.5 مل من 1x HBSS بعد الغسيل.
3. أضف 0.5 مل من 2.5٪ تربسين إلى 4.5 مل من HBSS واحتضنه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. اقلب الأنبوب كل 5 دقائق. يجب أن يصبح الحصين المهضوم جيدا لزجا ويشكل مجموعة. إذا لزم الأمر ، قم بتمديد عملية الهضم لمدة 5 دقائق أخرى.
4. اغسل الحصين باستخدام HBSS 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما. لا تستخدم مكنسة كهربائية لإزالة HBSS. من السهل جدا إزالة الحصين.
5. أضف 2 مل من HBSS بعد الغسيل وقم بتقطيع الحصين لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة باستور 15 مرة.
6. قم بترتيتر الأنسجة بماصة باستور مصقولة بالنار (يتم تضييق قطر الفتحة بمقدار النصف) 10 مرات. لا تتجاوز 10 مرات حتى لو كانت لا تزال هناك قطع متبقية. الإفراط في القص يقتل الخلايا العصبية.
7. ضع الأنبوب لمدة 5 دقائق حتى تتماسك جميع القطع في الأسفل. استخدم طرف ماصة سعة 1 مل برفق لنقل المادة الطافية التي تحتوي على الخلايا العصبية المنفصلة إلى أطباق الطلاء (10⁵ خلايا/طبق 60 مم). أضفه مباشرة إلى وسط الطلاء المحتضن مسبقا ورج الطبق برفق.
8. كرر الخطوات 2.6-2.7 مع القطع المتبقية حتى تختفي معظم القطع.
9. بعد 2-4 ساعات من البذر ، تحقق من أطباق الطلاء بمجهر ضوئي. يجب أن تكون غالبية الخلايا العصبية مرتبطة بالغطاء. الخلايا المرفقة مستديرة ومشرقة. اقلب الغطاء باستخدام ملقط طرف ناعم إلى أطباق تغذية الخلايا الدبقية مع وسط زراعة الخلايا الدبقية المشروط مسبقا مع توجيه جانب نقاط الشمع لأسفل.
10. يمكن أن تنمو الخلايا العصبية في أطباق تغذية الخلايا الدبقية لمدة تصل إلى شهر واحد. قم بتغذية الخلايا العصبية كل 7 أيام ب 1 مل من وسط زراعة الخلايا العصبية الطازجة.
11. خطوة اختيارية: بعد أسبوع واحد من البذر ، أضف السيتوزين أرابينوسيد (1-β-D-arabinofuranosylcytosine) إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر للحد من التكاثر الدبقي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 10xHBSS ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 14065-056 غطاء زجاجي 18 مم (1.5 D) فيشر ساينتيك 12-545-84-1 د 2.5٪ تريبسين بدون فينول أحمر ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 14065-056 ANK3-E22 / 23f / f الفئران جاكس رقم المخزون: 029797 بولي ليسين هيدروكلوريد سيجما ألدريتش هاتف: 26124-78-7 مكمل B27 الخالي من السيروم ثيرمو فيشر العلمي A3582801 DMEM ثيرمو فيشر العلمي 11995073 مكمل GlutaMAX-I ثيرمو فيشر العلمي A1286001 ليبوفيكتامين 2000 ثيرمو فيشر العلمي 11668030 MEM مع أملاح إيرل و L-glutamine ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 11095-080 الوسط العصبي القاعدي ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 21103-049 د-جلوكوز سيجما ألدريتش جي 7021 البنسلين - ستربتومايسين ثيرمو فيشر العلمي 15140122