توليد ثقافة الخلايا العصبية الأولية منخفضة الكثافة من الخلايا العصبية الجنينية المجمدة

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Koganezawa ، N. et al. ، ثقافة أولية منخفضة الكثافة سهلة وقابلة للتكرار باستخدام مخزون مجمد من الخلايا العصبية الجنينية في الحصين.J. Vis. Exp. (2023)

يوضح هذا الفيديو طريقة زراعة الخلايا العصبية الجنينية المحفوظة بالتبريد ، والتي تتضمن الذوبان المتحكم فيه ، والتخفيف بوسط عصبي قاعدي ، والبذر على صفيحة مطلية ب poly-L-lysine. تدعم الحضانة اللاحقة نمو وصيانة الروابط العصبية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

فئة < p = "jove_title" >1. طلاء اللوحة

1. قم بتغطية صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئرا ببولي L-lysine (1 مجم / مل ، مخفف في محلول بورات 0.1 متر [الرقم الهيدروجيني: 8.5] ؛ 100 ميكرولتر / بئر) واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية
   ملاحظه: قم فقط بتغطية الآبار التي يجب استخدامها. في التجارب التي أجريت هنا ، يتم استخدام الآبار ال 60 الوسطى. يتم تحضير عازلة البورات عن طريق خلط 50 ملي مولار من حمض البوريك و 12 ملي مولار من البورات في ماء معقم.
2. اغسل الطبق مرتين بالماء المعقم (250 ميكرولتر / بئر).
3. اغسل الطبق مرة واحدة بوسط استزراع طازج بدون مكملات غذائية (250 ميكرولتر / بئر).
4. جفف الطبق على مقعد نظيف لمدة 20 دقيقة.
5. لف اللوحة بورق الألمنيوم واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام (صالحة لمدة شهر واحد).

< p class = "jove_title" >2. بذر الخلايا

1. أضف 50 ميكرولتر / بئر من وسط الاستزراع إلى الصفيحة المطلية واحتفظ بها في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة. املأ الآبار الطرفية بالماء المعقم (200 ميكرولتر / بئر). < / > ملاحظه: يتم تحضير وسط الثقافة عن طريق إضافة 50x B-27 و 400x Glutamax و 100 U / مل من البنسلين / الستربتومايسين إلى الوسط العصبي القاعدي (راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل).
2. قم بإزالة الخلايا العصبية المبردة من خزان النيتروجين السائل. كانت الخلايا العصبية المستخدمة هنا عبارة عن خلايا عصبية ثنائي ميثيل سلفوكسيد بالتبريد (DMSO-المحفوظة بالتبريد).
3. اغمر التبريد في كتلة حرارية 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 دقائق وقم بإذابة المحتويات جزئيا. لا تقم بتسخين التبريد لفترة طويلة. انقل المحتويات إلى أنبوب سعة 50 مل بمجرد إذابته.
4. انقل محتويات الخلايا العصبية المبردة ببطء إلى أنبوب معقم سعة 50 مل بالتنقيط (50 ميكرولتر / ثانية) باستخدام ماصة سعة 1 مل ذات طرف واسع المسام.
5. اشطف التبريد الفارغ ب 1 مل من وسط الثقافة (درجة حرارة الغرفة ؛ RT). انقل هذا ال 1 مل من وسط الاستزراع من القطرة المبردة (50 ميكرولتر / ثانية) إلى أنبوب 50 مل يحتوي على تعليق الخلية.
6. أضف 9 مل من وسط الاستزراع (RT) إلى أنبوب 50 مل بالتنقيط (0.5 مل / ثانية) وقم بتعويض الحجم إلى 11 مل. لا تكرر سحب العينة ولكن امزج تعليق الخلية ببطء.
7. احسب رقم الخلية (استخدم عداد الخلايا أو مقياس كثافة الدم).
8. انقل كل تعليق الخلية إلى خزان وقم بتوزيع تعليق الخلية إلى اللوحة التي تتكون من 96 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات ذات أطراف واسعة المسام (1.0 × 10⁴ خلايا / بئر). لتقليل تبخر وسط الاستزراع ، املأ الآبار الطرفية بالماء المعقم (الخطوة 2.1).
   ملاحظه: تؤكد هذه الدراسة أن التبخر الوسيط المزروع صغير لمزرعة مدتها 3 أسابيع بدون تبادل متوسط. معدل تخفيض الوسط هو 3.6٪ (ن = 120 بئرا). وبالتالي ، لن يكون تغيير الأسمولية جذريا خلال فترة الحضانة التي تبلغ 3 أسابيع.
9. احتضان الخلايا العصبية لمدة 1-2 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
10. استبدل وسط الاستزراع ب 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) لكل بئر وأعده إلى حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ (لا يلزم تغيير متوسط أثناء الاستزراع).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 96 لوحة بئر شركة زيون الموهوبين 96 لوحة بئر غرينر 655986 ب -27 جيبكو 17504-044 2 فولت / v٪ للوحات MEA ؛ 50x للألواح العادية بورق سيغما ب -9876 التركيز النهائي 12 ملي حمض البوريك واكو 021-02195 التركيز النهائي 50 ملي ألبومين مصل الأبقار ميليبور 12659-100 جرام التركيز النهائي: 3٪ في PBS جلوتاماكس جيبكو 35050-061 2.5 ملي مولار لألواح MEA ؛ 400x للألواح العادية في محلل الخلية 2200 سيتيفا صور مضان العصبي العصبي جيبكو هاتف: 21103-049 البنسلين / الستربتومايسين جيبكو 15140-122 100 وحدة / مل للألواح العادية البنسلين / الستربتومايسين ناكالاي تيسكي هاتف: 26253-84 100 ميكروغرام / مل لألواح MEA بولي إل ليسين سيغما ص2636 مخفف في المخزن المؤقت للبورات (التركيز النهائي: 1 مجم / مل) السماء العصبية AlzMed ، Inc. أ.ر.ه001 1.0 × 106 خلايا / أنبوب