زراعة الخلايا العصبية المثيرة الفلورية من دماغ جرو الفأر المعدل وراثيا

الملخص

المصدر: Turko ، P. ، et al. ثقافة الخلايا الأولية للخلايا العصبية المنقاة GABAergic أو Glutamatergic التي تم إنشاؤها من خلال فرز الخلايا المنشط بالفلورة. J. Vis. Exp. (2019)

< ص فئة = "jove_content">يوضح الفيديو تقنية لزراعة الخلايا العصبية الفلورية GABAergic والجلوتاماتيرجيك من القشرة وأنسجة الحصين لصغار الفئران المعدلة وراثيا. تتضمن العملية الحصول على معلقات خلية واحدة منقاة من الخلايا العصبية ، وفرز الخلايا العصبية GABAergic بناء على تعبير البروتين الفلوري ، وبذرها على ألواح مطلية ب poly-L-lysine لتسهيل التعلق وتكاثر الخلايا.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

فئة < ص = "jove_title" >1. طلاء أغطية زجاجية مع بولي إل ليسين

1. قم بإعداد أغطية زجاجية عن طريق إذابة الجليد من 5 مل من محلول بولي إل ليسين (PLL). قم بتخفيف محلول المرق هذا إلى 20 ميكروغرام / مل عن طريق إضافة 45 مل من الماء النقي بدرجة الحقن. قم بتعقيم المحلول في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. قم بتسمية هذا الأنبوب باسم "PLL Sterile".
   ملاحظه: استخدم الماء المخزن في درجة حرارة الغرفة لتسريع عملية إزالة الجليد.
2. أضف 100 غطاء زجاجي معقم ودائري مقاس 12 مم إلى محلول PLL المعقم. حرك الأنبوب كل 5-10 دقائق ، لمدة 2-3 دقائق ، لضمان طلاء متساو. قم بتغطية الغطاء بهذه الطريقة لمدة 1 ساعة < / > ملاحظه: يفضل استخدام أغطية زجاجية مستديرة ألمانية الصنع (قطرها = 12 مم) ، لأنها توفر سطح ثقافة موثوقا به وتتناسب بسهولة مع آبار لوحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا.
3. بعد 40 دقيقة من طلاء PLL ، خذ قطعتين من المناديل الورقية وضعها بشكل مسطح في خزانة التدفق. عقم الورق باستخدام 70٪ إيثانول ، ثم افرده لإزالة التجاعيد واتركه حتى يجف.
4. بعد طلاء الأغطية الزجاجية لمدة 1 ساعة باستخدام PLL ، قم بإزالة محلول PLL الزائد وأضف ماء معقم بدرجة الحقن. حرك الغطاء برفق لمدة 2-3 ثوان للسماح بإزالة PLL الزائد. كرر خطوة الشطف هذه 2 مرات إضافية.
5. قم بإزالة الماء الزائد ، ثم انقل الغطاء إلى المناديل الورقية المعقمة. افصل كل غطاء بعناية باستخدام ملقط منحني واتركه حتى يجف.
   ملاحظه: يمكن التخلص من أغطية لا يمكن فصلها بسهولة. بدلا من ذلك ، يمكن إضافة كمية صغيرة من الماء للمساعدة في الفصل.
6. بمجرد أن يجف ، انقل الغطاء إلى لوحة ثقافة 24 بئرا.
   ملاحظه: يجب تجهيز أغطية الغطاء حوالي 30 دقيقة - 1 ساعة قبل بدء عملية التشريح. يمكن تخزين الأطباق في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ حتى الحاجة.

< p class = "jove_title" >2. تفكك الأنسجة الحصينية والقشرية

1. تحضير محاليل زراعة الخلايا
   1. لتفكك الأنسجة العصبية ، قم أولا بإذابة 40 مل من المخزن المؤقت لزراعة الخلايا (التركيب [بالملليمتر]: 116 كلوريد الصوديوم ، 5.4 كيلو كلوريد الصوديوم ، 26 NaHCO₃ ، 1.3 NaH₂PO₄ ، 1 MgSO₄ ·7H₂O ، 1 CaCl₂ · 2 H₂O ، 0.5 EDTA · 2Na · 2H₂O و 25 D-glucose ، الرقم الهيدروجيني = 7.4). قياس 12 مل من المخزن المؤقت لزراعة الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل ؛ تسمية "BSA". قم بقياس 5 مل من المخزن المؤقت لزراعة الخلايا إلى أنبوب مختلف سعة 15 مل ؛ تسمية "غراء". احتضان كلا الأنبوبين في حمام مائي لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   2. قم بتصفية وتعقيم المخزن المؤقت المتبقي لزراعة الخلايا ، وقم بتسميته على أنه "Buffer - Sterile" وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لحين الحاجة.
   3. وزن 120 ملغ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) وأضفه إلى الأنبوب المسمى "BSA". تزن 7 ملغ من غراء وأضفها إلى الأنبوب المسمى "غراء". أعد كلا الأنبوبين إلى الحمام المائي لمدة 15 دقيقة < / > ملاحظه: من المفيد إضافة كمية صغيرة من المخزن المؤقت إلى قارب الوزن لتسهيل نقل مسحوق البابين.
   4. بمجرد ذوبان جميع المساحيق ، قم بتعقيم كل محلول إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. بالنسبة لغراء الأنبوب ، قم بتسمية المحلول المصفى على أنه "غراء - معقم". بالنسبة للأنبوب BSA ، قسم محلول BSA المعقم إلى 3 أنابيب ، يحتوي كل منها على 4 مل من محلول BSA. قم بتسمية كل أنبوب على أنه "BSA - معقم" وإما "1" أو "2" أو "3". أعد جميع الأنابيب إلى الحمام المائي واستمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية لحين الحاجة.
2. التحضير لتشريح الأنسجة
   1. خذ قطعة واحدة من ورق الترشيح مقاس 35 مم (انظر جدول المواد) وقم بتعقيمها بنسبة 70٪ من الإيثانول ؛ اتركيها حتى تجف في غطاء طبق بتري مقاس 100 مم ، في خزانة تدفق. ضع المقص والملقط والمشرط والملعقة (انظر جدول المواد) المطلوب لتشريح الحصين والقشرة.
   2. ضع طبقين من بتري مقاس 35 مم وطبق بتري مقاس 100 مم يحتوي على ورق ترشيح معقم في مكان يمكن الوصول إليه في وسط خزانة التدفق.
   3. جمع NexCre المعدلة وراثيا. صغار الفأر Ai9 و VGAT Venus التي سيتم تشريحها. استخدم مصباح الفلورسنت مع مرشحات الإثارة والانبعاث المناسبة (انظر جدول المواد) للتمييز بين الجراء الفلورية ورفاقها من النوع البري.
   4. مباشرة قبل تشريح ، املأ كل طبق بتري مقاس 35 مم بمخزن مؤقت لزراعة الخلايا المبردة والمعقمة.
      ملاحظه: طبق بتري مخصص لتنظيف الأدوات بين التشريح ، والآخر لجمع الحصين والقشرة.
3. تشريح الأنسجة
   1. بمجرد سكب المخزن المؤقت لزراعة الخلايا ، اقطع رأس فأر أو جرو جرذ معدل وراثيا بعد الولادة باستخدام مقص كبير وحاد واستخدم طبق بتري معقم مقاس 100 مم لنقل الرأس إلى خزانة التدفق. استخدم الملقط والمقص والملعقة لنقل دماغ الجرو المعدل وراثيا بعناية إلى ورق ترشيح معقم.
   2. استخدم مشرط من النوع 22 لتشريح المخيخ وفصل نصفي الكرة الأرضية. استخدم ملعقة صغيرة للف نصفي الكرة الأرضية بشكل جانبي. في كل نصف كرة ، اضغط لأسفل برفق حتى تتلامس القشرة مع ورق الترشيح. حرك مناطق الدماغ المتوسط برفق للكشف عن الحصين والقشرة.
      ملاحظه: احرص على عدم الضغط كثيرا عند الضغط على نصفي الكرة الأرضية أو يمكن أن تسحق الخلايا.
   3. استخدم مشرطا أو ملعقة لفصل الحصين والقشرة عن كل نصف كرة كرية. انقل الأنسجة المقطعة إلى طبق بتري مقاس 35 مم يحتوي على مخزن مؤقت لزراعة الخلايا المبردة.
      ملاحظه: في حالة تشريح متعددة ، قم بتخزين مخزن ثقافة الخلايا المعقم في أنبوب مخروطي سعة 50 مل على الجليد. بعد كل تشريح ، انقل الأنسجة التشريح إلى المخزن المؤقت لزراعة الخلايا المبردة.
   4. بعد التشريح الناجح للأنسجة القشرية والحصين ، انقل محلول غراء المعقم من الحمام المائي إلى خزانة التدفق. استخدم ماصة باستور سعة 3 مل لنقل الحصين والقشرة المقطعين إلى غطاء طبق بتري معقم مقاس 35 مم. يقطع بحركة متقاطعة ، باستخدام الجزء المسطح من مشرط من النوع 22 ، حتى يصبح النسيج في قطع صغيرة.
   5. استخدم كمية صغيرة من محلول غراء لنقل الأنسجة المفرومة من غطاء طبق بتري إلى أنبوب غراء معقم. أعد أنبوب غراء إلى الحمام المائي واحتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
   6. أثناء حضانة غراء ، قم بتكوين محلول وسائط مضان كامل. قم بإذابة 1 مل من B27 ، و 0.5 مل من Glutamax و 0.5 مل من Pen-Strep. Aliquot 48.5 مل من السبات وسط مضان منخفض إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف B27 و Glutamax و Pen-Strep إلى المحلول. رج المحلول جيدا ، ثم قم بالتصفية والتعقيم وقم بتسميته على أنه "سبات وسائط كاملة" (مع التاريخ والأحرف الأولى). احتضن عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
   7. بعد حضانة غراء ، انقل أنبوب غراء وأنابيب BSA المعقمة إلى خزانة التدفق. استخدم ماصة باستور سعة 1 مل لإزالة الأنسجة القشرية والحصين فقط من أنبوب غراء إلى أنبوب BSA 1.
      ملاحظه: احرص على تقليل نقل محلول غراء الزائد.
4. تفكك الخلايا
   1. من أجل تفتيت أي كتل كبيرة من الأنسجة ، قم بتقطيع الأنسجة عدة مرات باستخدام ماصة باستور سعة 1 مل. بعد ذلك ، قم بتقطيع الأنسجة 7 مرات باستخدام ماصة باستور ذات طرف ناعم. اترك الأنسجة لتقف لمدة 30 ثانية ، مما يسمح لقطع أكبر من الأنسجة بالترسيب.
   2. بعد 30 ثانية ، انقل أقل 1 مل من المحلول والأنسجة من أنبوب BSA 1 إلى أنبوب BSA 2. قم بترتيث الأنسجة في أنبوب BSA 2 عدة مرات باستخدام ماصة باستور ذات طرف رفيع.
      1. بعد التجربة ، انقل مرة أخرى أقل 1 مل من الأنسجة والمحلول من أنبوب BSA 1 ، ولكن الآن إلى أنبوب BSA 3. قم بثلاثية الأنسجة في أنبوب BSA 3 عدة مرات باستخدام ماصة باستور ذات طرف رفيع.
      2. بعد التجربة ، انقل جميع المحاليل والأنسجة من الأنبوبين 2 و 3 إلى أنبوب BSA 1. ثلاثي 2-3 مرات أخرى وجهاز طرد مركزي عند 3,000 × جم لمدة 3 دقائق.
   3. أثناء الطرد المركزي ، قم بتكوين وسائط القاعدية العصبية الكاملة (وسائط الدوري الاميركي للمحترفين). Aliquot 48.5 مل من وسائط NBA إلى أنبوب مخروطي 50 مل وتحتضن عند 37 درجة مئوية في حمام مائي. تسمية هذا الأنبوب "الدوري الاميركي للمحترفين فقط". بالإضافة إلى ذلك ، قم بإذابة 1 مل من B27 ، و 0.5 مل من Glutamax و 0.5 مل من Pen-Strep في درجة حرارة الغرفة.
   4. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية من الأنسجة المحببة وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من الوسائط الكاملة. استخدم ماصة P1000 لترقيم الأنسجة لأعلى ولأسفل 20 مرة.
      ملاحظه: احرص على عدم ماصة الخلايا بقوة شديدة. إذا تم الضغط الشديد ، فقد تتلف الخلايا.
   5. استخدم ماصة باستور سعة 1 مل لتصفية معلق الخلية من خلال منخل خلية 30 ميكرومتر في أنبوب عينة من البوليسترين.
      ملاحظه: إذا لم يمر تعليق الخلية على الفور عبر غربال الخلية ، فقد يكون من الضروري الضغط على الجزء العلوي من الغربال بقفاز معقم لبدء التدفق. تمنع هذه الخطوة المهمة انسداد فارز الخلايا.
   6. لجمع الخلايا العصبية بعد الفرز ، قم بإعداد أنابيب التجميع عن طريق سحب 300 ميكرولتر من الوسائط الكاملة إلى العدد المطلوب من أنابيب البولي بروبلين.
   7. معلق الخلية جاهز الآن لنقله إلى فارز الخلايا للفرز. خذ تعليق الخلية وأنابيب التجميع الإضافية وقطع الغيار الوسائط الكاملة في حالة الحاجة إلى تخفيف العينة.

فئة < ص = "jove_title" >3. فرز الخلايا من الخلايا العصبية المنقاة GABAergic أو Glutamatergic

ملاحظة: لتقليل فرصة التلوث البكتيري أثناء الفرز ، اشطف أنبوب عينة الفرز بنسبة 70٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق على الأقل قبل الفرز. تختلف معلمات الفرز التفصيلية بين الأدوات ، والاعتبارات الأساسية هي كما يلي.

1. أثناء فرز الخلايا الأول ، حدد مستويات مضان الخلفية من الخلايا غير المسماة عن طريق فرز ومقارنة الخلايا من من النوع البري.
2. لكل نوع من أنواع الخلايا الفلورية المراد فرزها ، اختر مرشحات الإثارة والانبعاث المناسبة. إثارة بروتينات Venus و TdTomato باستخدام أطوال موجية للإثارة 488 نانومتر أو 531 نانومتر ، على التوالي. اكتشف الضوء المنبعث من خلال مجموعات مرشحات الانبعاث 530/40 و 575/30 ، على التوالي.
3. أضف أنابيب تجميع البولي بروبلين ، التي تحتوي على 300 ميكرولتر من الوسائط الكاملة ، إلى فارز الخلايا لتجميع الخلايا.
4. للحصول على نقاء عال ، قم بفرز الخلايا الفلورية ذات العلامات الزاهية (انظر الشكل 1 ب على سبيل المثال المخططات النقطية للخلايا التي تم فرزها).
5. بعد الفرز ، للحصول على أفضل النتائج ، قم بإجراء اختبار نقاء للخلايا التي تم فرزها لتقدير مستويات النقاء. لاحظ أن معدل الاسترداد النموذجي للخلايا بعد الفرز يتراوح بين 70-80٪.
6. قم بتدوين عدد الخلايا التي تم فرزها في كل أنبوب تجميع. يتم إعطاء هذه القيمة بواسطة أداة فرز الخلايا.
   ملاحظه: يمكن إجراء فرز الخلايا باستخدام فوهة 70 ميكرومتر (ضغط سائل غمد 70 رطل لكل بوصة مربعة) أو فوهة 100 ميكرومتر (ضغط سائل غمد 20 رطل لكل بوصة مربعة).

< p class = "jove_title" >4. زراعة الخلايا العصبية المصنفة

1. بعد فرز الخلايا ، انقل الخلايا المجمعة إلى أنابيب طرد مركزي دائرية القاع سعة 2 مل ، باستخدام ماصة باستور سعة 1 مل. الطرد المركزي للخلايا عند 3,000 × جم لمدة 3 دقائق لتشكيل حبيبات الخلية.
   ملاحظه: للمساعدة في تحديد موقع حبيبات الخلية ، قم بتوجيه أنابيب الطرد المركزي القاعية المستديرة بحيث تكون مفصلة الغطاء متجهة للخارج ، مما يسمح لحبيبات الخلية بالتشكل على الجزء الخلفي من أنبوب الطرد المركزي (أي على نفس جانب الأنبوب مثل المفصلة).
2. أثناء الطرد المركزي ، أضف 1 مل من B27 و 0.5 مل من Glutamax و 0.5 مل من Pen-Strep إلى 48.5 مل من وسائط NBA الدافئة مسبقا. رج المحلول جيدا ، ثم قم بالتصفية والتعقيم وقم بتسميته على أنه "وسائط NBA الكاملة" (مع التاريخ والأحرف الأولى). العودة إلى الحمام المائي لحين الحاجة.
3. بعد الطرد المركزي ، استخدم ماصة باستور سعة 1 مل لنقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي مختلف (احتفظ بالمادة الطافية في حالة إزعاج حبيبات الخلية). أعد تعليق حبيبات الخلية بالكمية المطلوبة من وسائط NBA الكاملة المسخنة مسبقا لتحقيق كثافة خلية تبلغ 1,000 خلية/ميكرولتر. أعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P200 أو P1000.
4. لتأكيد وجود خلايا منفصلة ، تحقق من محلول الخلية تحت المجهر ، باستخدام عدسة موضوعية 4x أو 10x. بدلا من ذلك، ضع كمية صغيرة من محلول الخلية على غطاء وافحصها تحت المجهر. في حالة وجود أعداد كبيرة من الخلايا ، يمكن التخلص من المادة الطافية من الخطوة 4.3.
5. قبل طلاء الخلايا ، قم بالدوامة على سرعة متوسطة لمدة 2-3 ثوان لضمان تعليق الخلية بشكل متساو. بعد الدوامة، قم بنقل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية بسرعة إلى مركز كل غطاء. بعد سحب الخلايا ، أعد كل لوحة بسرعة إلى الحاضنة (5٪ CO₂/37 °C) واحتضنها لمدة 1 ساعة
   ملاحظه: في حالة إضافة خلايا إلى ألواح متعددة مكونة من 24 بئرا ، تأكد من كثافة الخلايا المتساوية عن طريق دوامة الخلايا بين الألواح.
6. بعد 1 ساعة ، قم بتغذية الخلايا ب 500 ميكرولتر من وسائط NBA الكاملة الدافئة مسبقا والعودة إلى الحاضنة.
   ملاحظه: عند تغذية الخلايا ، من المهم ماصة الوسائط برفق أسفل جانب البئر لتجنب انفصال الخلية. بالنسبة للتجارب القصيرة (<16 يوما) ، فإن التغذية بالكثافة المذكورة أعلاه ليست ضرورية. عند طلاء كثافة أكبر من الخلايا ، قد تكون هناك حاجة إلى فترات تغذية أكثر تكرارا.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تنقية الخلايا العصبية الجلوتاماتيرجيك و GABAergic. (أ) صور تظهر إشارة الفلورسنت من التعبير الجيني المعدل ل TdTomato في NexCre؛ فئران Ai9 (أعلى) والزهرة في فئران VGAT Venus (أسفل). أشرطة المقياس = 5 مم. (ب) مخططات مبعثر شدة مضان TdTomato والزهرة للخلايا المنفصلة عن القشرة والحصين من NexCre ؛ فئران Ai9 (أعلى) وفئران VGAT Venus (أسفل). تم اختيار الخل...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات العصبية القاعدية أ الوسائط (الدوري الاميركي للمحترفين) ثيرموفيشر العلمي 10888022 المخزن المؤقت لثقافة الخلية ب 27 ثيرموفيشر العلمي 17504001 مكمل ثقافة جلوتاماكس ثيرموفيشر العلمي 35050-038 مكمل ثقافة البنسلين ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) ثيرموفيشر العلمي 15140-122 مضاد حيوي بولي L-يسين سيغما ص 1399 طلاء الغطاء غراء سيغما P4762-1G انزيم ألبومين مصل الأبقار سيغما أ 3294-100 جرام مصل السبات وسط مضان منخفض الدماغ بيتس المحدودة نصف وسائط النقل الخلوي ماصة باستور ذات الرأس الرفيع نيو لابز - تستخدم لتجربة الخلايا أطباق 24 بئر دينار بحريني 353047 لوحة الثقافة 50 مل أنابيب فالكون دينار بحريني 352070 - 15 مل أنابيب فالكون دينار بحريني 352096 - أغطية زجاجية: 12 مم دائرية روث ص231.1 - طبق بتري 35 مم كورنينج 353001 - طبق بتري 100 مم كورنينج 353003 - 30 ميكرومتر غربال خلية CellTrics سيسمكس 04-004-2326 لإزالة كتل الخلايا قبل فرز الخلايا أنابيب البوليسترين القاع المستديرة دينار بحريني 352054 أنبوب النقل للخلايا المصنفة أنابيب البولي بروبيلين القاع المستديرة دينار بحريني 352063 أنبوب التجميع للخلايا المصنفة مقص بون ناعم للغاية الأدوات العلمية الجميلة 14084-08 لإزالة الجلد والعظام المغطى بالفئران مقص ضيق للغاية الأدوات العلمية الجميلة 14088-10 لإزالة الجلد والعظام المغطى للفئران ملقط الأدوات العلمية الجميلة 11242-40 لتثبيت الرأس في مكانه ملعقة (بطول 130 مم / عرض طرف 5 مم) الأدوات العلمية الجميلة 3006.1 لإزالة الدماغ لتصفية الورق شفرات مشرط سوان مورتون #0308 لفصل الأنسجة العصبية ميكانيكيا مقياس ضغط الدم (Neubauer مرتجل) أوبتيك ليبور - لعدد الخلايا الخلايا المنفصلة