توليد أسلاف عصبية من الخلايا الجذعية الجنينية في مزارع أحادية الطبقة خالية من المصل

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Wongpaiboonwattana ، W. ، et al. التمايز العصبي للخلايا الجذعية الجنينية للفأر في ثقافة أحادية الطبقة الخالية من المصل. J. Vis. Exp.(2015)

يوضح الفيديو بروتوكولا يستخدم وسائط خالية من المصل لتوليد أسلاف عصبية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر. التركيز المطلوب للخلايا الجذعية الجنينية ، المعلقة في وسائط خالية من المصل ، مطلي على أغطية مغلفة بالجيلاتين. عند الكثافة المثلى للخلايا ، تنتج الخلايا عوامل إشارات أوتوكرين ، والتي ، جنبا إلى جنب مع العوامل المحفزة للتمايز العصبي في الوسائط الخالية من المصل ، تؤدي إلى تمايز الخلايا الجذعية الجنينية إلى أسلاف عصبية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إعداد الوسائط

ملاحظة: يعتمد البروتوكول على استخدام مزيج من وسائطين منفصلتين: DMEM / F12 مكمل N2 المعدل و Neurobasal المكمل بمكمل B27 ، عادة بنسبة 1: 1.

1. تحضير مكمل N2 المعدل عن طريق خلط المكونات في أنبوب سعة 15 مل. لا تقم بدوامة أو تصفية هذا. امزج عن طريق قلب الأنبوب حتى يصبح المحلول صافيا.
   1. ابدأ بسحب 7.2 مل من DMEM/F12، ثم أضف 1 مل من الأنسولين 25 ملغم/مل (يتكون من 0.01 مليون) وتخلط جيدا عن طريق قلب الأنبوب. يستغرق الأمر بضع دقائق حتى يصبح الحل واضحا.
   2. أضف 1 مل من 100 مجم / مل apo-transferrin (مكون من الماء) ، و 33 ميكرولتر من 0.6 مجم / مل من البروجسترون (المكون من الإيثانول) ، و 100 ميكرولتر من 160 مجم / مل (1 م) بوتريسين (مكون من الماء) ، و 10 ميكرولتر من 3 ملي مولار من سيلينيت الصوديوم (المكون من الماء) و 666 ميكرولتر من ألبومين مصل الأبقار بنسبة 7.5٪ واخلط الأنبوب جيدا. Aliquot في 2.5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
2. جهز وسائل الإعلام.
   1. إلى 250 مل من DMEM / F12 أضف 2.5 مل من N2. تخلط جيدا ولكن لا تهتز أو تصفيت.
   2. إلى 250 مل من الوسائط العصبية ، أضف 5 مل من مكمل فيتامين ب 27. تخلط جيدا ولكن لا تهتز أو تصفيت.
   3. امزج الوسائط من الخطوتين 1.2.1 و 1.2.2 بنسبة 1: 1. في بعض الحالات ، قد تكون هناك حاجة إلى مزيج 1: 3 (يتم استكماله كمزيج 1: 1 في الخطوة 1.2.4).
   4. أضف إلى المزيج 0.5 مل من L-glutamine (التركيز النهائي 0.2 مليمتر) و 3.5 ميكرولتر من 2-mercaptoethanol (التركيز النهائي 0.1 مليمتر) واخلطهم جيدا دون رج. قم بتخزين الوسائط في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع وتجنب تعرضها للضوء. هذا المزيج النهائي يسمى N2B27.
3. تحضير محلول الجيلاتين.
   1. قم بإعداد محلول جيلاتين 1٪ في ماء فائق النقاء والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة ، لمدة 15 دقيقة. من المهم أن تكون الزجاجة المستخدمة لهذا الغرض نظيفة تماما من المنظفات أو المطهرات ، لذلك يوصى باستخدام زجاجة جديدة لهذا الغرض ولا يتم شطفها إلا بالماء عالي النقاء بين الاستخدامات. قم بتقسيم محلول 1٪ إلى 50 مل واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
   2. قم بتسخين كمية من الجيلاتين بنسبة 1٪ في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يذوب وأضفه إلى 500 مل من المحلول الملحي الدافئ المخزن بالفوسفات (PBS). تخلط جيدا وتقطع بدرجة كافية لتغطية قاع كل بئر أو طبق. اترك الجيلاتين يغطي السطح لمدة 30 دقيقة على الأقل.

< p class = "jove_title" >2. طلاء الخلايا

ملاحظة: ينطبق هذا البروتوكول بالتساوي على الفئران ESC المزروعة في مصل 10٪ مع عامل مثبط لسرطان الدم (LIF) ، واستبدال المصل ب LIF أو الوسائط الخالية من المصل مع LIF والبروتين المورفوجيني للعظام 4 (BMP4) أو مثبطات MEK و GSK3 (وسائط 2i) مع أو بدون LIF. ومع ذلك ، قد يختلف توقيت وكفاءة التمايز اعتمادا على الوسائط والخلايا. بالنسبة للتجارب الموضحة هنا ، استخدمنا خط ESC للفأر 46C (مع مراسل EGFP الذي اصطدم بأحد أليلات Sox1 الداخلية) ، والتي نمت في GMEM مع مصل 10٪ و LIF. للحصول على أفضل النتائج ، من المهم أن يتم فصل الخلايا وإعادة طلاؤها في وسائط N2B27. يؤدي تغيير الوسائط ببساطة من GMEM / المصل / LIF إلى N2B27 دائما إلى انخفاض كفاءة التمايز مقارنة بإعادة طلاء الخلايا.

1. قم بزراعة الخلايا في GMEM مع مصل 10٪ ، و 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 1x من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 0.1 م 2-ميركابتو إيثانول ، و 100 وحدة / مل LIF13. للحصول على ثقافة فرعية من ESC للفأر ، قم بوضع 1 × 10⁶ خلايا في قارورة ثقافة T25 والتي ستستغرق 2-3 أيام.
2. راقب الخلايا تحت مجهر المجال الساطع. عندما تكون الخلايا متقاربة وجاهزة للمرور ، اشطفها مرتين في PBS. أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلية وأعد إلى الحاضنة لمدة 2-5 دقائق. على الرغم من أنه يمكن أيضا استخدام التربسين والإنزيمات الأخرى لتفكك الخلايا ، إلا أنها يمكن أن تؤثر سلبا على ارتباط الخلية ، لذلك يجب تعديل كثافة الطلاء.
3. بمجرد أن تبدأ الخلايا في الرفع من اللوحة ، اضغط على الوعاء لإخراجها في معلق خلية واحدة. اجمع الخلايا في 10 مل من الوسائط وكاشف تفكك الخلايا والماصة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
4. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في RT.
قم
5. بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من N2B27 الدافئ مسبقا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 3-5 مرات. عند سحب التعليق لأسفل، قم بسحب ماصة على جانب الأنبوب لتجنب تكوين فقاعات. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس كثافة الدم وسجل التركيز.
6. قم بإعداد معلق خلوي يحتوي على العدد المطلوب من الخلايا لكل وحدة حجم ليتم طلاؤها لكل بئر في N2B27 الدافئ مسبقا. كثافة 10,500 خلية لكل سم² في طبق مكون من 6 آبار (أي 1 × 10⁵ خلايا لكل بئر من طبق 6 آبار) هي الأمثل. انظر الجدول 1 لمعرفة العدد المقترح للخلايا لكل سم² وأحجام وسائط الطلاء لأوعية زراعة الخلايا المختلفة.
7. استنشق الجيلاتين من وعاء الاستزراع وقم بطلاء تعليق الخلية وفقا للكثافة والحجم المقترحين في الجدول 1. لا تقم بتدوير الألواح ، لأن هذا سيركز الخلايا في المركز. ضع المزارع في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
8. قم بتغيير الوسائط كل 1-2 أيام عن طريق استبدال جميع الوسائط ب N2B27 الجديد. قد يؤثر تنظيف الماصة برفق على الكثافة ويقلل من كفاءة التمايز في الأيام التالية. عندما تكون الجدوى الأولية بعد الطلاء ضعيفة ، قم بوضع الخلايا في مزيج 1: 3 من الوسائط المكملة ب N2 و B27 وقم بتغييرها إلى N2B27 بعد اليومين الأولين. ستبدأ الخلايا في التمايز ويجب أن تظهر تعبير Sox1 (المرئي من خلال التألق الأخضر للمراسل في خط الخلية 46C المستخدم هنا) في غضون 4-6 أيام.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. كثافات الطلاء المقترحة وأحجام الوسائط لأحجام الأوعية المختلفة. تم تحديد كثافة الطلاء في هذا الجدول باستخدام خط الخلية 46C. للحصول على أفضل النتائج ، قد يلزم تعديل كثافة الطلاء لكل خط على حدة.

رصيف نطاق الكثافة الفعالة (الخلايا / سم²) نطاق رقم الخلية إلى اللوحة حجم الوسائط الأولي المقترح (ميكرولتر) حجم الوسائط المقترح بعد اليوم 1 (ميكرولتر) 6 آبار لوحة 10,500 - 36,500 99,750 - 346,750 1,000 2,000 طبق 24 بئر 15,600 - 46,800 29,640 - 88,920 500 جنيه 1,000 لوحة 96 بئر 103,500 - 260,000 33,120 - 83,200 100 200 ريال

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مصل الأبقار الجنينية تقنيات الحياة 10270-106 DMEM / F12 تقنيات الحياة 11320-074 الوسط العصبي القاعدي تقنيات الحياة هاتف: 21103-049 كاشف تفكك الخلايا StemPro Accutase تقنيات الحياة أ11105-01 مكمل B-27 ، خال من المصل تقنيات الحياة 17504-044 إنسولين سيغما I6634 إعادة التكوين مع 0.01M حمض الهيدروكلوريك المعقم أبو ترانسفيرين سيغما تي 1147 إعادة التكوين بالماء المعقم البروجسترون سيغما ص 8783 إعادة التكوين بالإيثانول بوتريسين سيغما ص 5780 إعادة التكوين بالماء المعقم سيلينيت الصوديوم سيغما الطراز S5261 إعادة التكوين بالماء المعقم كسر الألبومين البقري V تقنيات الحياة هاتف: 15260-037 ل-جلوتامين تقنيات الحياة هاتف: 25030-081 تأكد من إذابته تماما قبل الاستخدام لأن الجلوتامين عادة ما يتم ترسيبه الجيلاتين سيغما جي 1890 6-صحن ثقافة الأنسجة الترمو: العلمية 140675 طبق زراعة الأنسجة 24 جيدا الترمو: العلمية 142475 طبق زراعة الأنسجة 96 جيدا الترمو: العلمية 167008 GMEM تقنيات الحياة 11710-035 مصل الأبقار الجنينية تقنيات الحياة 10270-106 محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM تقنيات الحياة 11140-050 بيروفات الصوديوم تقنيات الحياة هاتف: 11360-070 2-ميركابتو إيثانول سيغما M7522 قارورة زراعة الأنسجة 25 سم 2 الترمو: العلمية 156367