مقالة منهجية

توليد الخلايا العصبية الودية بعد العقدة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Wu ، H. F. ، et al. التمايز الفعال للخلايا العصبية المتعاطفة بعد العقدة باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في ظل ظروف ثقافة خالية من المغذيات ومحددة كيميائيا. J. Vis. Exp. (2020).

< p class = "jove_content">يوضح هذا الفيديو طريقة في المختبر لتوليد الخلايا العصبية المتعاطفة بعد العقدة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs). يتم تمايز hPSCs إلى خلايا قمة عصبية (NCCs) على دعم مصفوفة غشاء القاعدي باستخدام وسيط تمايز. ثم يتم فصل NCCs وتشكيلها في كرويات باستخدام وسيط تمايز آخر. أخيرا ، يتم تحويل الكرات إلى خلايا عصبية متعاطفة بعد العقدة باستخدام وسيط خلية عصبية متعاطفة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. إعداد لطلاء الأطباق وإعداد الوسائط وصيانة hPSC

  1. طلاء الطبق
    1. طلاء فيترونكتين (VTN)
      1. ضع قوارير VTN في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى تذوب تماما ، ثم تخلط جيدا.
      2. بالنسبة لطبق بتري مقاس 100 مم ، امزج 7 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) مع 0.5 مجم / مل VTN ، أضف محلول VTN إلى الطبق ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة.
    2. طلاء مصفوفة الغشاء القاعدي
      1. قم بإذابة قوارير مصفوفة الغشاء القاعدي (انظر جدول المواد) على الجليد عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
      2. للحصول على بئر واحد من صفيحة 6 آبار ، امزج 2 مل من خليط النسر المعدل / المغذيات F-12 (DMEM / F12) مع 20 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي 100x ، وأضف محلول مصفوفة الغشاء القاعدي إلى الطبق ، ولف الطبق بغشاء البارافين ، واحفظه في وعاء نظيف عند 4 درجات مئوية طوال الليل. اعمل في أسرع وقت ممكن. يمكن تخزين الأطباق المطلية في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
    3. طلاء البولي أورنيثين (PO) / اللامينين (LM) / الفيبرونيكتين (FN)
      1. في اليوم الأول ، لبئر واحد من صفيحة 24 بئرا ، امزج 15 ميكروغرام / مل من PO مع 1 مل من 1x PBS ، واحتضن عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 بين عشية وضحاها. قم بإذابة كل من LM و FN عند -20 درجة مئوية طوال الليل وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى تذوب تماما.
      2. في اليوم الثاني ، قم بشفط محلول الفم ، واغسل الآبار 2x باستخدام 1x PBS ، وأضف 1 مل من 1x PBS يحتوي على 2 ميكروغرام / مل من LM و 2 ميكروغرام / مل من FN واحتضانه عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 بين عشية وضحاها. في هذه المرحلة ، يمكن الاحتفاظ بالطبق بمحلول LM / FN في الحاضنة لعدة أشهر طالما أنه لا يجف. أضف المزيد من 1x PBS لمنع الطبق من الجفاف.
  2. إعداد وسائل الإعلام
    1. تحضير الوسط الأساسي 8 (E8) عن طريق إذابة زجاجة واحدة من مكمل E8 عند 4 درجات مئوية طوال الليل. امزج المكمل مع 500 مل من وسط E8 والمضادات الحيوية إذا لزم الأمر.
      ملاحظه: يجب استخدام محلول E8 العامل في غضون أسبوعين.
    2. قم بإعداد وسط التجميد hPSC عن طريق خلط 90 مل من وسط E8 الكامل مع 10 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لحجم إجمالي قدره 100 مل. تعقيم الفلتر.
    3. قم بإعداد وسط التمايز من اليوم 0 إلى اليوم 1 عن طريق خلط 100 مل من الوسط الأساسي 6 (E6) مع 10 ميكرومتر SB431542 ، و 1 نانوغرام / مل من البروتين المورفوجيني للعظم 4 (BMP4) ، و 300 نانومتر CHIR99021 ، و 10 ميكرومتر Y27632 لحجم إجمالي يبلغ 100 مل.
    4. قم بإعداد وسط التمايز من اليوم 2 إلى اليوم 10 عن طريق خلط 100 مل من وسط E6 مع 10 ميكرومتر SB و 0.75 ميكرومتر CHIR99021 للحصول على حجم إجمالي يبلغ 100 مل.
    5. جهز اليوم من 10 إلى اليوم 14 وسط كروي عن طريق خلط الوسط العصبي القاعدي مع 2 مل من B27 (50x) ، 1 مل من N2 (100x) ، 2 ملي L-Glutamate ، 3 ميكرومتر CHIR99021 ، و 10 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية -2 (FGF2) لحجم إجمالي قدره 100 مل.
    6. جهز اليوم 14 إلى اليوم 28 متوسطا للصيانة الكروية على المدى الطويل عن طريق إضافة 0.5 ميكرومتر من حمض الريتينويك الطازج (RA) إلى اليوم 10 إلى اليوم 14 وسط كروي لكل رضعة.
      ملاحظه: احتفظ دائما بالتهاب المفاصل الروماتويدي عند -80 درجة مئوية.
    7. قم بإعداد وسط نضج SymN عن طريق خلط الوسط العصبي القاعدي مع 2 مل من B27 (50x) ، 1 مل من N2 (100x) ، 2 ملي مولار L-glutamate ، 25 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF) ، 25 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) ، 25 نانوغرام / مل عامل نمو العصب (NGF) ، 200 ميكرومتر حمض الأسكوربيك ، و 0.2 ملي مولار ثنائي بوتيريل أحادي الفوسفات الدوري الأدينوزين (dbcAMP) لحجم إجمالي قدره 100 مل. يجب استخدام المحلول في غضون 2 أسابيع. قبل كل رضعة ، أضف 0.125 ميكرومتر من التهاب المفاصل الروماتويدي الطازج. يتم استخدام هذا الحل من اليوم 14 (الخيار 1) أو اليوم 28 (الخيار 2).
    8. قم بإعداد المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) عن طريق خلط DMEM مع 2٪ FBS و 2 ملي مولار L-glutamate والمضادات الحيوية إذا لزم الأمر لحجم إجمالي يبلغ 100 مل.
  3. صيانة hPSC
    1. ذوبان وحفظ hPSCs
      1. تحضير طبق واحد مطلي ب 100 مم.
      2. لإذابة قارورة من hPSCs مباشرة من النيتروجين السائل ، ضع القارورة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، مع تأرجح الأنبوب بعناية في الماء حتى يذوب. انقل hPSCs المذابة إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من 1x PBS ، وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق.
      3. تخلص من المادة الطافية وأضف 1 مل من وسط E8 إلى الأنبوب. الماصة عدة مرات لإعادة تعليق الحبيبات بالكامل ثم إضافة 9 مل أخرى من وسط E8 لتصل إلى 10 مل إجمالا.
      4. استنشق محلول VTN من الطبق 100 مم.
      5. انقل hPSCs إلى طبق 100 مم ، ورجه برفق (من أعلى إلى أسفل ومن اليسار إلى اليمين ، وليس في دوائر) للتأكد من توزيع الخلايا بالتساوي في الطبق
      6. احتضان عند 37 درجة مئوية ، في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
      7. في اليوم التالي ، استنشق كل الوسائط وأطعمه ب 10 مل من E8.
      8. أطعمي بهذه الطريقة كل يوم لمدة 3-4 أيام ثم استعد للانقسام.
    2. تقسيم hPSCs
      ملاحظة: يجب أن تكون hPSCs عند نقطة الانقسام متقاربة بنسبة 80٪ -90٪. يجب ملاحظة المستعمرات الكبيرة ذات الحواف الناعمة والمشرقة. ومع ذلك ، يجب تجنب الاتصال بين كل مستعمرة (الشكل 1 ب ، اليوم 0 والشكل 4 ب).
      1. قم بإعداد أطباق 100 مم مطلية ب VTN حسب الحاجة.
      2. استنشق E8 واغسل الطبق الذي يجب تقسيمه 1x مع 1x PBS.
      3. قم باستنشاق 1x PBS وأضف 4 مل من 0.25 M EDTA. احتضان لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
        ملاحظه: يجب تقسيم / إعادة طلاء hPSCs كمستعمرات صغيرة. لا تعالج بحمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) لمدة تزيد عن دقيقتين لمنع الانفصال إلى خلايا مفردة. يجب أن تظل الخلايا متصلة بسطح الطبق بعد العلاج لمدة دقيقتين.
      4. قم بشفط EDTA ، وافصل المستعمرات عن طريق سحب 10 مل من وسط E8 بقوة على سطح الطبق ، واجمع كل الوسط والخلايا في أنبوب سعة 15 مل.
      5. مع hPSCs عند التقاء 80٪ -90٪ ، انقسم المستعمرات بنسبة 1: 15-1: 20. على سبيل المثال ، لتقسيم hPSCs بمقدار 1:20 في طبق واحد 100 مم ، خذ 500 ميكرولتر من محلول E8 / hPSCs واخلطه مع 9.5 مل من وسط E8 الطازج.
      6. لوحة hPSCs في أطباق 100 مم مطلية ب VTN.
        ملاحظه: ينصح بتحديد نسبة الانقسام المثالية لكل باحث وخط خلية بشكل مستقل.
    3. تجميد hPSCs
      1. للحصول على طبق واحد مقاس 100 مم من hPSCs جاهز للتقسيم ، قم بإعداد ثلاثة كريات مبردة و 3.5 مل من وسط التجميد.
        ملاحظة: يجب حفظ الوسائط والقوارير في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو على الثلج حتى الاستخدام.
      2. استنشق E8 واغسل الطبق 2x مع 1x PBS.
      3. قم بالشفط 1x PBS وأضف 4 مل من 0.25 M EDTA ، واحتضنه لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية ، في 5٪ CO2.
        ملاحظة: يجب تجميد hPSCs كمستعمرات صغيرة في الوقت الذي سيتم تقسيمها. لا تعالج الخلايا باستخدام EDTA لمدة تزيد عن دقيقتين لمنع الانفصال إلى خلايا مفردة. يجب أن تظل الخلايا متصلة على سطح الطبق بعد 2 دقيقة من العلاج.
      4. قم بشفط EDTA ، وافصل المستعمرات عن طريق سحب 10 مل بقوة من 1x PBS على سطح الطبق ، واجمع كل الوسائط والخلايا في أنبوب سعة 50 مل.
      5. أضف 20 مل من 1x PBS وجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق لغسل EDTA المتبقي.
      6. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 3 مل من وسط التجميد.
      7. وزعي hPSCs بالتساوي في التبريد الثلاثة، 1 مل لكل منها.
      8. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية طوال الليل في صندوق تجميد متحكم فيه أو شطيرة من الستايروفوم لضمان انخفاض بطيء في درجة الحرارة ، ثم ينقل إلى خزان نيتروجين سائل للتخزين طويل الأجل.
< p class = "jove_title" >2. بذر hPSCs لبدء التمايز (اليوم 0)

ملاحظة: يجب أن تكون hPSCs جاهزة للتمايز بعد استقرارها (أي يتم تقسيمها 2-3x بعد الذوبان). تأكد من أن المستعمرات صحية ، ذات حواف ناعمة ولامعة ، والحد الأدنى من التمايز (الشكل 2 ب).

  1. قم بإعداد أطباق مغلفة بمصفوفة غشاء القاعدي (24 بئر أو 6 أطباق بئر) قبل يوم واحد من اليوم 0 حسب الحاجة. أحضر الأطباق إلى RT في بداية التمايز.
  2. اجعل اليوم 0-1 وسيط تمايز حسب الحاجة.
  3. استنشق E8 من التقاء ، جاهزا لتقسيم hPCSs ، واغسل الطبق 2x مع 1x PBS.
  4. أضف 7 مل من 0.25 م EDTA لكل طبق 100 مم ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 ، لمدة 15 دقيقة
    ملاحظه: في هذه المرحلة ، يتم إطالة فترة علاج EDTA لتشتت إلى خلايا مفردة.
  5. قم بإزالة جميع hPSCs (يجب أن تكون عائمة) ونقلها إلى أنبوب سعة 50 مل. أضف نفس الكمية أو أكثر من 1x PBS مثل محلول EDTA لتخفيف EDTA.
  6. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق.
  7. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 1 مل من وسط التمايز اليومي 0-1 والماصة لتجانس الخلايا. اتبع ذلك بإضافة المزيد من الوسيط ثم امزجه لتخفيف محلول الخلية إلى تركيز مثالي لحساب الخلايا.
    ملاحظه: لا تفرط في تخفيف محلول الخلية. يجب تخفيف الخلايا من طبق واحد كامل 100 مم في 5 مل من الوسط للبدء.
  8. احسب رقم الخلية باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس كثافة الدم.
  9. قم بتخفيف محلول الخلية حسب الحاجة للوصول إلى 125,000 خلية / سم2 في حجم نهائي منخفض (على سبيل المثال ، 2 مل لكل بئر لطبق 6 بئر أو 500 ميكرولتر لكل بئر لطبق 24 بئر).
    ملاحظه: يساعد الحجم المنخفض الخلايا على الالتصاق بشكل أسرع.
  10. استنشق كل محلول مصفوفة الغشاء القاعدي من الأطباق المطلية وقم بطلاء محلول الخلية في الآبار.
  11. احتضان عند 37 درجة مئوية ، في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
< ص الفئة = "jove_title" >3. تحريض خلية القمة العصبية (اليوم 1 إلى اليوم 10 ، الشكل 1 أ)

  1. في اليوم 1 ، قم بإطعام الخلايا بوسط تمايز في اليوم 0-1 (3 مل لكل بئر ل 6 أطباق آبار و 1 مل لكل بئر ل 24 طبقا جيدا).
  2. في اليوم 2 ، قم بتغذية الخلايا بوسط تمايز في اليوم 2 - يوم 10 (3 مل لكل بئر ل 6 أطباق جيدة و 1 مل لكل بئر ل 24 طبقا جيدا).
  3. من الآن فصاعدا ، يجب إطعام الخلايا كل يومين حتى اليوم العاشر (أي أن يوم التغذية التالي سيكون اليوم 4).
    ملاحظه: من اليوم 6 فصاعدا ، يجب الكشف عن تلال NC (الشكل 1 ب). للتحقق مما إذا كان التمايز يحدث ، ينصح بحمل ثقافة تمايز متوازية في الآبار الأصغر (أي 24 بئرا) ، والتي يمكن تلطيخها ل SOX10 / AP2a واستخدامها للتعبير الجيني الواسماني طوال وقت التمايز (الشكل 1 ب ، ج).
  4. في حالة فرز الخلايا ، انتقل إلى القسم 4. خلاف ذلك ، انتقل إلى القسم 5.
< p class = "jove_title" >4. فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) لعلامة القمة العصبية CD49D وتجميع خلايا NC في الكرويات

ملاحظة: لفرز FACS ، يجب حفظ العينات على الجليد وعدم تعريضها للضوء بعد تلطيخها حتى الفرز.

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت FACS إذا تم فرز الخلايا.
  2. تحضير اليوم 10-14 وسط كروي.
  3. في اليوم 10 ، قم بإزالة الوسيط ، واغسل 1x باستخدام 1x PBS.
  4. أضف محلول التفكك (انظر جدول المواد) بمعدل 2 مل لكل بئر لطبق 6 آبار أو 1 مل لكل بئر لطبق 24 بئر ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 20 دقيقة.
  5. قم بإزالة جميع hPSCs ونقلها إلى أنبوب سعة 50 مل.
  6. املأ باقي الأنبوب بمخزن FACS المؤقت والطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق < br / > ملاحظه: يمكن أن يستوعب كل أنبوب سعة 50 مل ما يصل إلى 20 مل أو أقل من محلول الخلية. يجب أن يكون حجم المخزن المؤقت FACS مرتفعا بما يكفي لتحييد محلول التفكك.
  7. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا بالكمية المناسبة من المخزن المؤقت FACS (~ 2 مل لكل بئر من لوحة 6 آبار) ، واعدها لتحديد رقم الخلية.
  8. قم بإعداد العينات التالية.
    1. العينة 1 (تحكم غير ملطخ): 1 × 106 خلايا في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. قم بتصفية الخلايا من خلال غطاء مصفاة 20 ميكرومتر واحتفظ بالأنبوب على الجليد.
    2. العينة 2 (تحكم DAPI فقط): 1 × 106 خلايا في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). قم بتصفية الخلايا من خلال أنبوب FACS بغطاء مصفاة واحتفظ بالأنبوب على الجليد.
    3. العينة 3 (تحمل علامة CD49D): قم بتعليق بقية الخلايا مع المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على الجسم المضاد CD49D المترافق فيكوريثرين / السيانين 7 (PE / Cy7) (5 ميكرولتر لكل 1 × 106 خلية لكل 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS) في أنبوب سعة 15 مل واحتضانه على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  9. املأ الأنابيب بمخزن FACS المؤقت وجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق.
  10. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليقها كل 5-10 × 106 خلايا في 1 مل من المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل DAPI وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  11. قم بتصفية الخلايا من خلال أنبوب FACS باستخدام غطاء المصفاة واحتفظ بالأنبوب على الجليد.
  12. قم بإعداد أنابيب FACS للتجميع التي تحتوي على 2 مل من عازلة FACS.
  13. قم بالفرز من خلال جهاز FACS باستخدام أجهزة الليزر التي يمكنها اكتشاف DAPI و PE-Cy7 لعزل مجموعة CD49D +.
  14. بعد الفرز ، عد الخلايا التي تم فرزها.
  15. جهاز الطرد المركزي جميع الخلايا التي تم فرزها وإعادة تعليقها في اليوم 10-14 وسط كروي إلى تركيز نهائي يبلغ 0.5 × 106 خلايا لكل 500 ميكرولتر من الوسط.
  16. لوحة 0.5 × 106 خلايا لكل بئر في مرفق منخفض للغاية 24 لوحة بئر.
  17. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
< p class = "jove_title" >5. تجميع خلايا NC في الكرويات

  1. إذا لم يتم استخدام FACS لعزل خلايا NC وبدلا من ذلك تجميعها إلى كرويات مباشرة ، فقم أولا بإعداد الخلايا كما هو موضح في الخطوات 4.2-4.5.
  2. املأ باقي الأنبوب ب 1x PBS ، وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق.
  3. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا بكمية مناسبة من اليوم 10-14 وسط كروي (على سبيل المثال ، ~ 2 مل من الوسط لكل بئر للوحة 6 آبار) ، واعدها لتحديد رقم الخلية.
  4. خفف الخلايا في اليوم 10-14 وسط كروي إلى 0.5 × 106 خلايا لكل 500 ميكرولتر من الوسط.
  5. لوحة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر في مرفق منخفض للغاية 24 لوحة بئر.
  6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
< p class = "jove_title" >6. صيانة NC الكروية وتحريض السلف الودي (اليوم 10 إلى اليوم 14 ، الشكل 3 أ)

  1. الخيار 1: الحد الأدنى من الثقافة الكروية
    1. في اليوم 11 ، أضف 500 ميكرولتر من اليوم 10-14 من الوسط الكروي إلى الكرات NC دون شفط الوسط الموجود من اليوم 10. احتضان عند 37 درجة مئوية ، في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    2. في اليوم 12 ، قم بإمالة اللوحة لتجميع كرويات NC على جانب واحد من الآبار. قم بالشفط بعناية وتخلص من أكبر قدر ممكن من الوسط ، وأطعمه ب 1 مل من الوسط الكروي 10-14 اليوم.
    3. استمر في تغذية الخلايا كل يوم حتى اليوم 14.
    4. اختياري: إذا تجمعت الكرويات وولدت كتلة كبيرة ، فاستخدم ماصة لتفتيت التكتلات الكروية. هذا يضمن أيضا أن الكرات الفردية لا تصبح كبيرة جدا.
      ملاحظه: يجب أن يكون نطاق الحجم الكروي المثالي حوالي 100-500 ميكرومتر. ضمن هذا النطاق ، فإن حجم الكرويات الفردية ليس حرجا. ومع ذلك ، فإن التشكل ، مثل الحواف الناعمة والواضحة (الشكل 2 والشكل 4) مهم لمزيد من النجاح. في اليوم 14 ، تحتوي كل صفيحة 24 بئرا بشكل مثالي على حوالي 50-60 كروية بأحجام مختلفة ضمن نطاق الحجم المذكور أعلاه.
  2. الخيار 2: توسيع الثقافة الكروية
    1. في اليوم 15 ، للحفاظ على كرويات NC ، تتغذى على 1.5 مل من اليوم 10-14 وسط كروي يحتوي على 0.5 ميكرومتر RA. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
      ملاحظه: يجب إضافة RA طازجا لكل تغذية وتخزينه دائما عند -80 درجة مئوية.
    2. من الآن فصاعدا ، قم بإطعامه كل يومين حتى اليوم 28 ثم استمر في طلاء الكرات (القسم 7.1).
      ملاحظه: يتم تقسيم الكرات الكروية المتنامية حوالي 1x في الأسبوع عن طريق ماصتها بماصة سعة 1 مل لتفتيتها. يتم تقسيمها بنسبة تقريبية من 1: 2 - 1: 4. خلال فترة التوسع لمدة أسبوعين ، يجب أن يتضاعف عدد الخلايا أربع مرات تقريبا.
< p class = "jove_title" >7. تمايز الخلايا العصبية الودية (SymN) والنضج (الخيار 1: بعد اليوم 14 ؛ الخيار 2: بعد اليوم 28)

  1. طلاء الكرويات في الأطباق العادية
    1. قم بإعداد 24 لوحا مطلي ب PO / LM / FM.
    2. قم بإعداد وسيط symN يحتوي على 0.125 ميكرومتر RA (أضف كل تغذية طازجة) و 10 ميكرومتر Y27632 (اليوم 14 فقط).
    3. في اليوم 14 ، قم بإمالة اللوحة لتراكم كرويات NC على جانب واحد من الآبار. استنشق بعناية وتخلص من أكبر قدر ممكن من الوسط ، وأطعمه ب 1 مل من وسيط symN.
    4. قم بإزالة LM / FN من الألواح المطلية.
    5. قم بتقسيم كل بئر ووصفه من صفيحة 24 بئر إلى 4 آبار منفصلة من لوحة 24 بئر الجديدة المطلية. سيحتوي كل بئر أصلي على 1 مل ، يحتوي على ~ 50-60 كرويا. ينتج عن هذا 250 ميكرولتر ، تحتوي على ما يقرب من 10-15 كروية لكل بئر على اللوحة الجديدة.
    6. أضف 250 ميكرولتر من الوسط الإضافي لكل بئر.
      ملاحظه: هذا انقسام 1: 4. تأكد من توزيع الكرات بشكل صحيح داخل المحلول بحيث يكون الانقسام متساويا نسبيا. لا يتم احتساب عدد الكرويات لأن الرقم النهائي لا يؤثر على نجاح إنشاء symNs.
    7. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    8. في اليوم 15 (أو اليوم 29 للخيار 2) ، قم بالتغذية عن طريق استبدال كل الوسائط ب 1 مل من وسط symN الذي يحتوي على 0.125 ميكرومتر RA. من الآن فصاعدا ، يجب تغذية الخلايا العصبية كل يومين حتى اليوم 20 (أو اليوم 35 للخيار 2).
    9. بعد اليوم 20 (أو اليوم 35 للخيار 2) ، يجب تغذية الخلايا العصبية عن طريق استبدال نصف الوسط الموجود فقط (500 ميكرولتر) بعناية. من الآن فصاعدا ، قم بإطعامه كل أسبوع ما لم يتحول الوسط بسرعة إلى اللون الأصفر.
    10. استمر في التغذية أسبوعيا حتى النقطة الزمنية المطلوبة.
      ملاحظة: تميل symN إلى التجمع في هياكل تشبه العقد وتكون عرضة للانفصال عن أطباق الثقافة. لمنع ذلك ، يوصى بنصف التغذية والحد الأدنى من المناولة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: تحريض NC. (أ) الجدول الزمني والعلاجات لتحريض NC من اليوم 0 إلى اليوم 10. (ب) تمت مراقبة مورفولوجيا وتشكيل نتوءات NC كل يومين بواسطة الفحص المجهري للمجال الساطع. تم تلطيخ الخلايا في كل نقطة زمنية بعد اليوم 2 بشكل مشترك ل AP2A (أحمر) و SOX10 (أخضر). تم تلطيخ جميع صور التألق المناعي باستخدام DAPI. تشير الأسهم الحمراء إلى هياكل التلال. (ج

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أطباق زراعة الخلايا 100 مم صقر 353003 15 مل أنابيب زراعة الأنسجة المخروطية VWR / كورنينج 89039-664 24 بئر لوحات زراعة الأنسجة صقر 353047 24 بئر لوحات منخفضة جدا كورنينج 07 200 601 و 07 200 602 5٪ ثاني أكسيد الكربون2/20٪ O2 حاضنة زراعة الأنسجة ثيرمو فيشر / تقنيات الحياة هيراسيل فيوس 160i 50 مل أنابيب زراعة الأنسجة المخروطية VWR / كورنينج 89039-656 6 ألواح زراعة الأنسجة كوستار 3516 أكوتاز تقنيات خلايا الابتكار AT104500 حل تفكك الخلايا الجسم المضاد ل AP2a أبكام أب108311 المضيف: أرنب ؛ 1: 400 تخفيف الأجسام المضادة ل Ascl1 BD Pharmingen 556604 المضيف: الماوس IgG1 ؛ تخفيف 1: 200 الأجسام المضادة ل CD49D بيو ليجند 304313 المضيف: Mouse IgG1 ؛ 5 ميكرولتر / مليون خلية في حجم 100 ميكرولتر الجسم المضاد المضاد ل CD49D (النمط المتماثل) بيو ليجند 400125 المضيف: Mouse IgG1 ؛ 5 ميكرولتر / مليون خلية في حجم 100 ميكرولتر الجسم المضاد المضاد ل DAPI سيغما د9542 1: 1000 تخفيف الجسم المضاد ل DBH إيمونوستار هاتف: 22806 المضيف: أرنب ؛ تخفيف 1: 500 الأجسام المضادة ل GFP أبكام أب13970 المضيف: دجاج؛ 1: 1000 تخفيف الأجسام المضادة ل HOXC9 سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية ع ع -365692 المضيف: الماوس IgG1 ؛ تخفيف 1: 100 الجسم المضاد ل NET1 ماب نيت 17-1 المضيف: الماوس ؛ 1: 1000 التخفيف الأجسام المضادة ل PRPH سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية الفئة SC-377093/H0112 المضيف: الماوس IgG2a ؛ تخفيف 1: 200 الجسم المضاد ل SOX10 أبكام أب50839 المضيف: الماوس ؛ تخفيف 1: 100 الأجسام المضادة المضادة ل TH بيل فريز ص 40101 - 150 المضيف: أرنب ؛ تخفيف 1: 500 حمض الأسكوربيك سيغما أ 8960-5 جي تركيز المخزون: 100 ملي مكمل B27 ثيرمو فيشر / تقنيات الحياة هاتف: 12587-010 تركيز المخزون: 50x BDNF أنظمة البحث والتطوير 248-دينار بحريني تركيز المخزون: 10 ميكروغرام / مل BMP4 أنظمة البحث والتطوير 314-BP تركيز المخزون: 6 ملم عداد الخلية ثيرمو فيشر / تقنيات الحياة الكونتيسة الثانية شرائح غرفة عد الخلايا إنفيتروجين ج 10312 الطرد المركزي إيبندورف 57021 و 5424 ص CHIR99021 أنظمة البحث والتطوير 4423 تركيز المخزون: 6 ملم قارورة التبريد ثيرمو فيشر / تقنيات الحياة 375353 ديسيبل أمبير سيغما د0627 تركيز المخزون: 100 ملي DMEM ثيرمو فيشر / تقنيات الحياة 10829-018 تركيز المخزون: 1x DMEM / F12 ثيرمو فيشر / تقنيات الحياة هاتف: 11330-057 تركيز المخزون: 1x DMSO ثيرمو فيشر / تقنيات الحياة بي ت 231-100 E6 متوسط جيبكو أ15165-01 E8 متوسط جيبكو أ15169-01 تركيز المخزون: 1x ملحق E8 جيبكو أ15171-01 تركيز المخزون: 50x EDTA سيغما ED2SS تركيز المخزون: 0.5 م آلة FACS بيكمان كولتر CytoFLEX (ل FACS) آلة FACS بيكمان كولتر MoFlo Astrios EQ (للفرز) أنابيب FACS (غطاء مرشح أزرق) صقر 352235 أنابيب FACS (غطاء أبيض) صقر 352063 مصل الأبقار الجنينية (FBS) أتلانتا بيولوجيكس S11150 GDNF بيبروتك 450 ريال تركيز المخزون: 10 ميكروغرام / مل جيلتريكس إنفيتروجين A1413202 مصفوفة الغشاء القاعدي تركيز المخزون: 100x hPSCs طومسون وآخرون ، (1998) وا09 hPSCs أوه وآخرون (2016) H9-PHOX2B :: eGFP فيبرونيكتين بشري (FN) VWR / كورنينج هاتف: 47743-654 تركيز المخزون: 1 مجم / مل ل-جلوتامين ثيرمو فيشر / جيبكو هاتف: 25030-081 تركيز المخزون: 200 ملي خزان LN أنظمة بيوجينيك مخصصة V-1500AB لامينين الفأر الأول (LM) أنظمة البحث والتطوير 3400-010-01 تركيز المخزون: 1 مجم / مل مكمل N2 ثيرمو فيشر / تقنيات الحياة 17502-048 تركيز المخزون: 100x الوسط العصبي القاعدي جيبكو هاتف: 21103-049 تركيز المخزون: 1x NGF بيبروتك 450-01 تركيز المخزون: 25 ميكروغرام / مل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) جيبكو 14190-136 تركيز المخزون: 1x بولي إل أورنيثين هيدروبروميد (PO) سيغما ص 3655 تركيز المخزون: 15 مجم / مل بريموسين (مضادات حيوية) إنفيفوجين ANTPM1 تركيز المخزون: 50 مجم / مل آلة qPCR مختبرات بيو راد C1000 اللمس لوحات qPCR مختبرات بيو راد HSP9601 المؤتلف FGF2 أنظمة البحث والتطوير 233-FB / CF تركيز المخزون: 10 ميكروغرام / مل حمض الريتينويك سيغما R2625 تركيز المخزون: 1 ملي SB431542 أنظمة Tocris / R & D 1614 تركيز المخزون: 10 ملم تريبان بلو كورنينج MT-25-900-CI فيترونكتين (VTN) ثيرمو فيشر / تقنيات الحياة أ 14700 تركيز المخزون: 0.5 مجم / مل حمام مائي VWR / كورنينج 706308 Y27632 أنظمة البحث والتطوير 1254 تركيز المخزون: 10 ملم

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EDTA

مقالات ذات صلة