توليد وتمايز المجالات العصبية الأولية من الخلايا الجذعية العصبية لأسماك الزرد

الملخص

المصدر: Lopez-Ramirez ، M. A. et al. ، عزل وثقافة المجالات العصبية المشتقة من الدماغ البالغ لأسماك الزرد البالغة.J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو توليد وتمايز المجالات العصبية الأولية. تتكاثر الخلايا الجذعية العصبية من أسماك الزرد ، في وجود عوامل النمو ، في مجالات عصبية عائمة بحرية مع قدرة التجديد الذاتي ، والتي تتمايز لاحقا إلى خلايا دبقية وخلايا عصبية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الاستعدادات

1. قم بإعداد 10 مل من وسط التشريح ، وأضف 200 ميكرولتر من 100x البنسلين والستربتومايسين إلى 9.8 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM / F12).
2. تحضير محلول L-سيستين: إلى 10 مل من الماء لزراعة الأنسجة, وإضافة 120 ملغ من L-سيستين. قم بتخزين محلول L-cysteine عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين أو في كميات عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
3. تحضير محلول DNase I: إلى 1 مل من الماء لزراعة الأنسجة ، أضف 10 مجم من DNase I. قم بتخزين محلول DNase I عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
4. تحضير محلول غراء: لتحضير محلول غراء ، أضف 100 ميكرولتر من غراء (حوالي 140 وحدة) ، و 100 ميكرولتر DNase I (1٪) ، و 200 ميكرولتر من L-cysteine (12 مجم / مل) إلى 5 مل من DMEM / F12. قم بإعداد محلول غراء طازجا في كل مرة وقم بتعقيمه باستخدام فلتر بحجم المسام 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام.
5. تحضير محلول الغسيل: لتحضير 100 مل من محلول الغسيل ، أضف 650 ميكرولتر من الجلوكوز 45٪ ، 500 ميكرولتر 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك ، HEPES 1 M و 5 مل مصل بقري الجنين (FBS) في 93.85 مل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco 1x. عقم محلول الغسيل بفلتر بحجم المسام 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام. قم بتخزين محلول الغسيل في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
6. تحضير محلول الأنسولين: لتحضير 2 مل من محلول الأنسولين ، أضف قطرة 25 ميكرولتر من 10 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) و 100 مجم من الأنسولين في 2 مل من الماء لزراعة الأنسجة.
7. تحضير محاليل عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية (FGF): قم بإذابة كل من الميتوجينات في DMEM / F12 بتركيز 100 ميكروغرام / مل. يخزن على شكل 10 ميكرولتر من الحصص عند -20 درجة مئوية.
8. تحضير وسائط B-27 و N-2: قم بتخزين مكملات B-27 و N-2 عند -20 درجة مئوية مثل 500 ميكرولتر و 1 مل على التوالي.
9. تحضير وسط حالة التمايز Z: لتحضير 100 مل من وسط حالة التمايز Z ، أضف 40 ميكرولتر من الأنسولين (50 مجم / مل) ، و 500 ميكرولتر B-27 ، و 1 مل N-2 ، و 650 ميكرولتر جلوكوز 45٪ و 1 مل من 100 × البنسلين - الستربتومايسين في 97.81 مل من DMEM / F12. عقم وسط حالة التمايز Z باستخدام مرشح حجم المسام 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام. قم بتخزين وسط حالة التمايز Z عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
10. تحضير وسط حالة Z: لتحضير 50 مل من وسائط Z-condition ، أضف 10 ميكرولتر من EGF و 10 ميكرولتر من FGF إلى 50 مل من وسط حالة التمايز Z المعقم (20 نانوغرام / مل). قم بتخزين وسط Z-condition عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
11. تحضير محلول الطلاء لثقافة التمايز: للحصول على محلول طلاء خارج الخلية سعة 5 مل ، أضف 100 ميكرولتر من محلول المصفوفة خارج الخلية (على سبيل المثال ، Matrigel) إلى 4.9 مل من DMEM / F12. قم بإذابة محلول المصفوفة خارج الخلية عند 4 درجات مئوية على الجليد. بمجرد إذابة الثلج ، يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.

2. تشريح دماغ الزرد البالغ

1. قم بإعداد سرير تشريح عن طريق ملء طبق بتري مقاس 100 مم × 15 مم بكياسات ثلج هلامية. ثم ضع الغطاء على طبق بتري واحتضنه عند -20 درجة مئوية حتى يتجمد الجل. في الجزء العلوي من الغطاء ، ضع مربعا من ورق الترشيح النظيف ولف ورق الترشيح وطبق بتري بغشاء بلاستيكي.
2. قم بتنظيف وتعقيم جميع أدوات التشريح الدقيق بنسبة 70٪ من الإيثانول أو الحرارة قبل كل استخدام. ضع جميع أدوات التشريح المعقمة بالقرب من مجهر التشريح ، وقبل القتل الرحيم مباشرة ، ضع سرير التشريح تحت المجهر بإضاءة الألياف الضوئية.
3. اجمع 2 من أسماك الزرد البالغة لتحضير الغلاف العصبي للدماغ بالكامل ؛ و 3 إلى 4 أسماك زرد لتوليد المجالات العصبية من مناطق الدماغ التشريح.
4. القتل الرحيم لسمك الزرد البالغ (8-12 شهرا) باستخدام بروتوكول معتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه. بعد ذلك ، اغمر السمكة في 75٪ من الإيثانول لمدة 5-10 ثوان وضعها بسرعة في سرير التشريح متبوعا بقطع الرأس على مستوى الخياشيم باستخدام شفرة جراحية.
   1. للقتل الرحيم للحيوانات، قم بإعطاء جرعة زائدة (300 ملغم/لتر) من سلفونات تريكايين ميثان حتى تتباطأ ضربات قلب تدريجيا وتتوقف الدورة الدموية، ثم اغمرها في الماء المثلج.
5. اقلب الجانب الظهري للرأس لأسفل ، واستخدم المقص قم بعمل قطع طولي من الجانب المقطوع إلى الفم. باستخدام الملقط ، كشف قاعدة الجمجمة وإزالة جميع الأنسجة المجاورة. قطع الجدران الجانبية للجمجمة من بداية الحبل الشوكي باتجاه التكتوم.
6. باستخدام المقص ، قم بقص وإزالة الأعصاب البصرية ثم قم بإزالة جانبي الجزء الجانبي من الجمجمة على مستوى التكتم. اقلب الجانب البطني للرأس لأعلى. باستخدام الملقط ، انزع باقي الجزء القمي من الجمجمة.
7. انقل الدماغ مع الجزء المتبقي من الجمجمة إلى طبق جديد مع وسط التشريح (1.1). نظف أنسجة المخ في وسط التشريح باستخدام المقبض البلاستيكي للسكين الصغير ، مع الحفاظ على جميع هياكل الدماغ سليمة.
8. من هذه النقطة ، استمر في البروتوكول باستخدام دماغ الزرد بالكامل.
   1. بدلا من ذلك ، قم بتكييف هذا البروتوكول مع مناطق معينة من الدماغ لتوليد المجالات العصبية من دماغ الزرد بأكمله أو من الدماغ أو الدماغ / الدماغ أو المخيخ الذي تم تشريحه بمشرط جديد. استخدم خطا عصبيا معدلا وراثيا لسمك الزرد الفلوري العصبي لتشريح منطقة الدماغ ذات الاهتمام وفقا للشكل 1.

< p class = "jove_title" >3. تفكك الخلية المفردة للدماغ البالغ

1. قم بأداء جميع الأعمال اللاحقة في خزانة السلامة البيولوجية. انقل أنسجة المخ إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 800 ميكرولتر من وسط التشريح (محضر في الخطوة 1.1). قم بإزالة وسط التشريح عن طريق سحب العينات، دون لمس أنسجة الدماغ.
2. أضف 500 ميكرولتر من محلول غراء (الخطوة 1.4) وهضم أنسجة المخ عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. لا تحتضن لمدة تزيد عن 15 دقيقة لأنها قد تقلل من صلاحية الخلية.
3. بعد الحضانة ، انقل أنسجة المخ مع 500 ميكرولتر من محلول غراء إلى أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام طرف ماصة 1,000 ميكرولتر مقطوع عند ~ 0.25 بوصة من الأسفل. قم بفصل أنسجة المخ برفق عن طريق سحب العينات ببطء لأعلى ولأسفل 10 مرات بنفس الحافة. لا تقم بسحب الأنابيب لأعلى ولأسفل أكثر من 15 مرة ولا تولد فقاعات هواء خلال هذه الخطوة ، لأنها قد تغير قابلية الخلية للبقاء.
4. احتضان أنسجة المخ مرة أخرى عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق متبوعا بسحب العينة لأعلى ولأسفل 10-13 مرة باستخدام طرف عادي غير مقطوع 1,000 ميكرولتر. لا تسحب لأعلى ولأسفل أكثر من 15 مرة لتجنب موت الخلايا.
5. أوقف الهضم الأنزيمي بإضافة 2 مل من محلول الغسيل (الخطوة 1.5) وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بصب المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في المحلول المتبقي عن طريق النقر على الأنبوب بقوة بإصبع ثم عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل بطرف منتظم 1,000 ميكرولتر. بعد ذلك ، أضف 2 مل من محلول الغسيل.
6. في هذه المرحلة ، تحقق تحت المجهر من أنه تم الحصول على تعليق خلية واحدة. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية مرة أخرى عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند RT. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات باستخدام 1 مل من وسط Z-condition الطازج (الخطوة 1.10).
7. قم بتلطيخ الخلايا باستخدام التريبان الأزرق وعد الخلايا الحية باستخدام مقياس كثافة الدم عن طريق استبعاد الخلايا الزرقاء الميتة. قم بإعداد صفيحة من 24 بئرا مع 200 ميكرولتر من تعليق الخلية و 300 ميكرولتر من وسط Z الطازج في كل بئر. خلايا البذور بكثافة ~ 500 خلية / ميكرولتر. الحفاظ على الخلايا المستزرعة في حاضنة عند 30 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} ، لأن المجالات العصبية المشتقة من الدماغ من أسماك الزرد لا تنمو جيدا عند 37 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >4. توليد المجالات العصبية الأولية

1. بعد يوم واحد في المختبر (DiV1) ، لاحظ تعليق الخلية المفردة التي تم الحصول عليها من الدماغ الكامل للبالغين تحت المجهر ولاحظ ما إذا كان الحطام قد تراكم في وسط البئر. قم بإزالة أي حطام بعناية عن طريق سحب ما يقرب من 100 ميكرولتر من الوسط (أقل إن أمكن). بعد ذلك أضف 100 ميكرولتر من وسط Z-condition الطازج. يجب ملاحظة معلقات الخلية المفردة في هذا الوقت (الشكل 2 أ DiV1).
2. بعد يومين في المختبر (DiV2) ، قم بتوسيع الخلايا المستنبتة. باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر مع قطع الطرف، اجمع وانقل 250 ميكرولتر من تعليق الخلية من كل بئر إلى بئر جديد. أضف 250 ميكرولتر من وسط Z الطازج في جميع الآبار. قبل توسيع الخلايا المستنبتة ، قم بتجانس المعلق برفق شديد عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل في جميع أنحاء البئر.
3. كرر الخطوتين 4.1 و 4.2 لمدة 4 أيام التالية في المختبر (DiV4). يجب أن تكون الزيادة التدريجية في حجم المجالات العصبية مرئية في مركز وحواف البئر في DiV3 و DiV4 (الشكل 2B و C).
   ملاحظه: يمكن معالجة المجالات العصبية الأولية للمرور أو التمايز لتقييم تعدد القدرات. بدلا من ذلك ، يمكن معالجتها من أجل النواة أو تعداء الدهون لتوصيف دور جينات معينة أثناء عملية التمايز.

< p class = "jove_title" >5. مرور المجالات العصبية الأولية

1. قم بإزالة 250 ميكرولتر من زراعة الأنسجة من كل بئر وفصل المجالات العصبية DiV4 ميكانيكيا باستخدام ماصة سعة 1 مل. لا تقم بسحب الأنابيب لأعلى ولأسفل بسرعة كبيرة لأن تكوين فقاعة الهواء قد يزيد من موت الخلايا.
2. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم وتوزيع 800 خلية / ميكرولتر في 250 ميكرولتر من المادة الطافية المزروعة الأولية في كل بئر من صفيحة 24 بئرا.
3. أضف 250 ميكرولتر من وسط حالة Z إلى كل بئر.
4. بعد يومين في المختبر (DiV2) ، قم بتوسيع الخلايا المستنبتة كما هو مذكور في الخطوتين 4.2 و 4.3.

< p class = "jove_title" >6. تمايز المجالات العصبية الأولية

1. قم بتعقيم أكواب الغطاء عن طريق الغمر في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق ، ثم جفف أكواب الغطاء في RT عن طريق وضعها في كل بئر من لوحة 12 بئرا.
2. أضف 300 ميكرولتر من محلول الطلاء خارج الخلية (الخطوة 1.11) في وسط زجاج الغطاء بحيث يمكن أن يتمدد على نطاق واسع ويغطي زجاج الغطاء بالكامل. ثم احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (باستخدام حاضنة زراعة الخلايا المرطبة).
3. قم بإزالة محلول الطلاء خارج الخلية بعد الحضانة ، وجفف زجاج الغطاء لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
4. قم بإزالة 250 ميكرولتر من زراعة الأنسجة من كل بئر. قم بفصل جميع المجالات العصبية الأولية DiV4 ميكانيكيا لكل بئر باستخدام ماصة سعة 1 مل (ذات طرف أوسع) عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
5. معلقات خلايا الغلاف العصبي المنفصلة للبذور بكثافة خلية 4 × 10³ خلايا / مل على أكواب غطاء مغلفة بالمصفوفة خارج الخلية المعدة مسبقا (الخطوة 6.1-6.3) واحتفظ بها لمدة 30 دقيقة على الأقل ، عند 30 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون_{2 ،} حتى تلتصق بالركيزة. بعد ذلك ، قم بإزالة وسط الثقافة وأضف بسرعة 1 مل من وسط حالة التمايز Z الطازج الدافئ مسبقا (الخطوة 1.9) قبل زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة عند 30 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
6. كل يومين ، استبدل نصف وسط حالة التمايز Z خلال وقت تمايز الخلايا.

النتائج

الشكل 1: تمايز المجالات العصبية المشتقة من الدماغ من أسماك الزرد.(A-C ، E) صور تباين الطور للمناطق العصبية المشتقة من الدماغ بالكامل المزروعة في وسط التمايز Z خلال 1 (A ، DiVd1) و 3 (B ، DiVd3) و 4 (C و D ، DiVd4) أيام. (ه) منظر ظهري للدماغ كله لأسماك زرد Tg (GFAP: D...

المواد