طريقة في المختبر لتوليد عضيات الدماغ البشري

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Gabriel, E., et al., جيل من عضيات الدماغ البشري المشتقة من iPSC لنمذجة اضطرابات النمو العصبي المبكرة. J. Vis. إكسب. (2017)

يوضح الفيديو طريقة لتوليد عضيات الدماغ البشري من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. يوضح كيف يشكل الغلاف العصبي طبقة من الأديم العصبي ، والتي تمنع تكوين طبقات جرثومية أخرى. يتم تضمين المجالات العصبية في مصفوفة هلامية ثلاثية الأبعاد وتشكل براعم ظهارية عصبية. عند احتضانها بوسائط عضوية ، تتمايز هذه البراعم الظهارية العصبية إلى مناطق معينة في الدماغ ، مما يؤدي إلى تكوين عضيات دماغية ناضجة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< ص الفئة = "jove_title" >1. توليد عضيات الدماغ (23 يوما)

1. بدء الأديم الظاهر العصبي (5 أيام) < br / > ملاحظة: يجب مراعاة النقاط التالية قبل بدء التمايز. طريقة إعادة البرمجة (عدوى-, فيروس سينداي-, عرضي-, أو microRNA المستندة إلى إلخ.) للحصول على iPSCs البشرية يجب أن تكون هي نفسها من الناحية المثالية لجميع المرضى والسيطرة على خطوط iPSC. تتوفر مجموعات وتعليمات مختلفة لإعادة البرمجة بناء على البروتوكولات المنشورة. جودة خطوط iPSC البشرية هي المفتاح لتحقيق التمايز الأمثل. راقب مورفولوجيا المستعمرة والخلايا بالمجهر وتحقق من تعدد القدرات عن طريق اختبار التعبير عن علامات مثل Oct3 / 4 أو Nanog أو TRA-1-60.
   1. استزراع iPSCs البشرية تحت ظروف خالية من المغذيات في متوسط A على طبق مغلفة ب Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) مصفوفة.
      ملاحظه: تنمو iPSCs البشرية خالية من المغذيات وخالية من المصل للحفاظ على حالة مزرعة محددة وتجنب خطوة إضافية لإزالة الخلايا المغذية الجنينية للفأر (MEFs) قبل بدء التمايز. يتراوح رقم التمرير الأمثل ل iPSCs البشرية لبدء التمايز من المقطع 15 عند إعادة البرمجة إلى التمرير 70 في المجموع. عند المرور ، افصل مستعمرات hiPSC حيث تتجمع الخلايا باستخدام محلول مناسب لفصل الخلايا مع ضغط ميكانيكي منخفض وماصة مصلية سعة 2 مل لنقل الركام إلى طبق جديد. تجنب التفكك إلى الخلايا المفردة, لأن هذا قد يؤدي إلى التمايز وموت الخلايا المبرمج في معظم خطوط iPSC. وأفيد أن على المدى الطويل, مرور خلية واحدة يمكن أن تزيد من التغيرات الجينومية في iPSCs البشرية. تجنب إجراءات انفصال الخلايا, التي تتطلب خطوة الطرد المركزي لإزالة محلول الانفصال, لأن هذا يقلل من الجدوى الإجمالية ل iPSCs. اختبار جميع الثقافات للتلوث الجرثومي, خاصة الميكوبلازما, على أساس منتظم, لأن هذا قد يغير جودة iPSCs وقدرتها على التمايز.
      1. قم بتغطية طبق زراعة الأنسجة مقاس 60 مم بمصفوفة EHS وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      2. قم بإذابة كمية من 1 × 10⁶ iPSCs البشرية. بذر iPSCs في 60 مم صحن زراعة الأنسجة المغلفة في مصفوفة EHS وتحتوي على 5 مل من متوسط A (انظر جدول المواد). قم بتغيير الوسط يوميا والمرور بعد 5 إلى 7 أيام عندما تصل الخلايا إلى ~ 80٪ من التقاء.
         ملاحظه: تمرير iPSCs مذاب في 80٪ التقاء باستخدام الطرق القياسية, مثل انفصال مستعمرات خالية من الإنزيم, مرة واحدة على الأقل قبل البدء في التمايز. باختصار, إزالة الوسط iPSC, اغسل الخلايا مرة واحدة مع التسخين المسبق 37 درجة مئوية دولبيكو النسر المعدل المتوسطة: خليط المغذيات F-12 (DMEM/F12), واحتضان iPSCs بعد تعليمات الشركة المصنعة باستخدام كاشف A (انظر جدول المواد). لا تتجاوز وقت الحضانة الموصى به لتجنب التفكك إلى الخلايا المفردة. يجب فصل iPSCs البشرية وعائمة كمجاميع, وليس كخلايا مفردة. يمكن بعد ذلك نقلها إلى أطباق جديدة مغطاة بمصفوفة EHS ؛ على سبيل المثال, يمكن توزيع مجاميع iPSC من طبق واحد 60 مم إلى 4 أطباق جديدة 60 مم.
         b. تحقق من وجود الميكوبلازما باستخدام مجموعة أدوات الكشف عن الميكوبلازما وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدام فقط iPSCs خالية من الميكوبلازما, كما يمكن للميكوبلازما تغيير القدرة على التمايز من iPSCs.
2. تفكيك iPSCs (80٪ ملتقاء) وإعداد تعليق خلية واحدة باستخدام الكاشف B
   1. اغسل iPSCs مرة واحدة باستخدام DEM/F12 المسخن مسبقا (37 درجة مئوية).
   2. إضافة كاشف التسخين مسبقا ب (على سبيل المثال, 1 مل في طبق 60 مم) واحتضان iPSCs لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   3. نفض الغبار 20 مرات بطرف الإصبع على جانب وأسفل الطبق لفصل iPSCs. تحقق من انفصال الخلايا تحت المجهر.
   4. ماصة تعليق الخلية لأعلى ولأسفل في الطبق 5 مرات باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 مل.
   5. أضف 3 مل من المتوسط A لتخفيف 1 مل من الكاشف B وجمع تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
   قم
   6. بتدوير iPSCs برفق (500 × جم) لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المتوسط B واحسب رقم الخلية باستخدام مقياس الدم.
      ملاحظه: كن على دراية باستخدام متوسط B فقط لإعادة التعليق. تجنب استخدام الوسيط A ، لأنه يحتوي على تركيز عال جدا من bFGF ، مما قد يمنع التمايز.
3. قم بتخفيف معلق الخلية إلى 4.5 × 10⁵ خلايا لكل مل في الوسط B مع 10 ميكرومتر مثبط بروتين كيناز مرتبط بالrho (Y-27632).
4. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر في طبق غير ملتصق ، قاع V ، 96 بئر.
   ملاحظه: تأكد من توزيع الخلايا بالتساوي في المعلق عن طريق هز الأنبوب في كل مرة قبل إخراج أجزاء 100 ميكرولتر. من المهم أن يحتوي كل بئر على رقم خلية مكافئ من أجل الحصول على مجالات عصبية متجانسة في الحجم والشكل (أسطح مستديرة ومحددة).
5. قم بتدوير اللوحة برفق مع الخلايا عند 500 × جم ودرجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
6. قم بتغيير الوسط يوميا عن طريق إزالة 50 ميكرولتر وإضافة 50 ميكرولتر من متوسط الوسط الطازج B إلى كل بئر لمدة 5 أيام قادمة.

< p class = "jove_title" >2. تضمين المجالات العصبية في مصفوفة البيئة والصحة والسلامة (4 أيام)

1. قم بإعداد وسط الغلاف العصبي عن طريق خلط ما يلي: خليط 1: 1 من DMEM / F12 ومتوسط C (v / v) ، 1: 200 (حجم / حجم) ملحق 1 ، 1: 100 (حجم / حجم) ملحق 2 بدون (بدون / س) فيتامين أ ، 1: 100 لتر جلوتامين ، 0.05 ملي مولار أحماض أمينية غير أساسية (MEM) ، 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 1.6 جم / لتر أنسولين ، و 0.05 ملي مولار β-ميركابتو إيثانول.
2. اجمع المجالات العصبية باستخدام ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر باستخدام طرف ~ 2 مم تم قطعه مسبقا بمقص معقم.
3. ضع المجالات العصبية على بعد حوالي 5 مم من بعضها البعض على فيلم البارافين (3 × 3 سم²) في طبق فارغ مقاس 100 مم وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط المتبقي بعناية.
4. أضف قطرة (7 ميكرولتر) من مصفوفة البيئة والصحة والسلامة على كل مجال عصبي واحد.
5. احتضان قطرات مصفوفة البيئة والصحة والسلامة مع المجالات العصبية لمدة 15 دقيقة في حاضنة.
6. اغسل المجالات العصبية بعناية من فيلم البارافين عن طريق غسلها بوسط الغلاف العصبي. للتنظيف ، استخدم ماصة دقيقة سعة 1 مل وطبق بتري جديد مقاس 100 مم يحتوي على 10 مل من وسط الغلاف العصبي.
7. احتضان المجالات العصبية لمدة 4 أيام القادمة وأضف 2 مل من وسط الغلاف العصبي الطازج في اليوم 2.
   ملاحظه: تأكد من أن الأرفف في الحاضنة مسطحة حتى لا تتكتل المجالات العصبية المضمنة في مصفوفة البيئة والصحة والسلامة معا على جانب واحد من الطبق.

فئة

3. العضيات في ثقافة التعليق الدوار (14 يوما)

1. تحضير وسط عضوي للدماغ عن طريق خلط ما يلي: خليط 1: 1 من DMEM / F12 ومتوسط C (v / v) ، 1: 200 (v / v) الملحق 1 ، 1: 100 (v / v) مكمل غذائي 2 مع فيتامين أ ، 1: 100 لتر جلوتامين ، 0.05 ملي مولار MEM ، 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 1.6 جم / لتر أنسولين ، 0.5 ميكرومتر دورسومورفين ، 5 ميكرومتر SB431542 ، و 0.05 ملي مولار β-ميركابتو إيثانول.
2. أضف 100 مل من الوسط العضوي للدماغ إلى كل قارورة دوار من خلال أذرعها الجانبية وضعها في حاضنة للتسخين المسبق لمدة 20 دقيقة على الأقل.
3. قم بإعداد برنامج تقليب عند 25 دورة في الدقيقة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   ملاحظه: قبل نقل المجالات العصبية المضمنة في مصفوفة EHS إلى قوارير دوارة ، تأكد من فصلها جميعا. إذا تم توصيل اثنين أو أكثر من خلال مصفوفة EHS ، فقم بفصلهما عن طريق قطع مصفوفة التوصيل بمشرط.
4. انقل المجالات العصبية المضمنة في مصفوفة EHS بعناية إلى قوارير دوارة تحتوي على 100 مل من الوسط العضوي باستخدام ماصة مصلية سعة 2 مل. استخدم الأذرع الجانبية للقارورة الدوارة لنقل المجالات العصبية إلى القارورة.
5. ضع قوارير الدوار على منصة تحريك مغناطيسية في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} ؛ هذا هو اليوم 0 من الثقافة العضوية.
6. قم بتغيير الوسط مرة واحدة في الأسبوع (أو في كثير من الأحيان عندما يكون هناك تغيير في اللون) عن طريق إزالة نصف الوسط وإضافة نفس الكمية من الوسط الطازج.
   ملاحظه: عند إخراج قوارير الدوار من الحاضنة ، انتظر 3-5 دقائق للسماح للعضيات بالغرق في قاع القارورة. قم بإزالة الوسيط عن طريق وضع طرف الماصة الزجاجية (المتصل بمضخة) على سطح السائل ؛ استنشق الوسط بعناية من خلال فتحة / ذراع جانبية واحدة من القارورة. يجب أن تتم هذه التلاعبات تحت غطاء المحرك الصفحي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM / F-12 جيبكو ، الولايات المتحدة 31331093 وسط النسر المعدل من Dulbecco: خليط المغذيات F-12 دورسومورفين سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة ص 5499 المجمع C تضمين وسيط AppliChem أ 9011 ، 0100 Mowiol; تضمين الوسط; موردين متعددين مصفوفة Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) كورنينج 354277 مصفوفة مؤهلة من Matrigel hESC ؛ هام: مؤهل hESC إنسولين سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة I3536-100MG ل-جلوتامين جيبكو ، الولايات المتحدة 25030081 L-جلوتامين (200 ملم) متوسط أ تقنيات الخلايا الجذعية #05850 mTeSR1 (متوسط hiPSC) متوسط ب تقنيات الخلايا الجذعية #05835 وسط الحث العصبي (NIM) ؛ وسيط التمايز العصبي وسط ج جيبكو ، الولايات المتحدة 21103049 الوسط القاعدي العصبي MEM جيبكو ، الولايات المتحدة 11140035 محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100x) طقم الكشف عن الميكوبلازما MycoAlert لونزا، سويسرا #LT07-218 طقم الكشف عن الميكوبلازما. موردين متعددين البنسلين الستربتومايسين (10.000 وحدة / مل) جيبكو ، الولايات المتحدة 15140122 الكاشف أ تقنيات الخلايا الجذعية # 05872 ReLSR (اختيار الخلايا البشرية الخالية من الإنزيم ES و iPS وكاشف التمرير) ؛ يرجى اتباع بروتوكول manufactorer الكاشف ب سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة A6964-100 مل محلول Accutase هو حل إنزيمي لتفكك الخلية المفردة ؛ موردون متعددون ؛ بروتوكول 1.1.2 "محلول تفكك الخلايا الأنزيمية" ملحق 1 جيبكو ، الولايات المتحدة 17502048 ملحق N-2 (100x) الملحق 2 مع فيتامين أ جيبكو ، الولايات المتحدة 12587010 مكمل B-27 (50x) ، ناقص فيتامين أ SB431542 Selleckchem.com S1067 قارورة دوارة 250 مل IBS Integra Bioscience 182026 ورقة مقاومة للماء شركة BEMIS ، Inc. PM996 بارافيلم "M" Y-27632 Selleckchem.com S1049 مثبط الصخور (Y-27632 2HCL) β ميركابتو إيثانول جيبكو ، الولايات المتحدة 31350010 2-ميركابتو إيثانول (50 ملم)