$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
p class = "jove_title" >1. تصميم وتصنيع رقاقة متعددة القنوات ، شفافة بصريا ، كهروتكتيكي (MOE)
- ارسم أنماط لطبقات بولي ميثيل ميثاكريلات الفردية (PMMA) والشريط على الوجهين باستخدام البرنامج المناسب (الشكل 1 أ ، جدول المواد). قم بقص كل من صفائح PMMA والشريط على الوجهين باستخدام آلة كتابة ليزر CO2 (الشكل 1 ب).
- قم بتشغيل آلة كتابة ليزر CO2 وقم بتوصيله بجهاز كمبيوتر شخصي. افتح ملف النمط المصمم باستخدام البرنامج.
- ضع صفائح PMMA (275 مم × 400 مم) أو الشريط على الوجهين (210 مم × 297 مم) على منصة آلة كتابة الليزر (الشكل 2 أ). قم بتركيز الليزر على سطح أوراق PMMA أو الشريط على الوجهين باستخدام أداة التركيز البؤري التلقائي.
- حدد آلة كتابة الليزر كطابعة ، ثم "طباعة" النمط باستخدام آلة كتابة الليزر لبدء الاستئصال المباشر على ورقة PMMA أو الشريط على الوجهين والحصول على أنماط فردية على ورقة أو شريط PMMA (الشكل 2 ب).
- قم بإزالة الطبقة الواقية من صفائح PMMA وتنظيف السطح باستخدام غاز النيتروجين. < / >
ملاحظه: تم إجراء رسم نمط PMMA والمعالجة المباشرة لورقة PMMA وفقا لتقرير سابق.
- لربط طبقات متعددة من صفائح PMMA معا ، قم بتكديس ثلاث قطع من صفائح PMMA مقاس 1 مم (الطبقات 1 و 2 و 3) ، وربطها تحت ضغط 5 كجم / سم2 في رابط حراري لمدة 30 دقيقة عند 110 درجة مئوية لتشكيل مجموعة قناة التدفق / التحفيز الكهربائي (الشكل 2 ج). < / >
ملاحظه: الدفعات المختلفة من صفائح PMMA التي تم الحصول عليها تجاريا لها درجات حرارة انتقال زجاجية مختلفة قليلا (Tg). يجب اختبار درجة حرارة الترابط المثلى بزيادات قدرها 5 درجات مئوية بالقرب من Tg.
- قم بلصق 12 قطعة من المحولات على الفتحات الفردية في الطبقة 1 من مجموعة رقاقة وزارة التربية والتعليم باستخدام غراء سيانواكريليت سريع المفعول. < / >
ملاحظه: المحولات مصنوعة من PMMA عن طريق القولبة بالحقن. الأسطح المسطحة في الأسفل مخصصة للتوصيل بشريحة وزارة التربية والتعليم. المحولات التي تحمل خيوط لولبية أنثوية 1 / 4W-28 مخصصة لتوصيل المقابس البيضاء الضيقة أو الموصلات السفلية المسطحة أو محولات Luer. كن حذرا عند استخدام غراء سيانواكريليت سريع المفعول. تجنب تناثر العينين.
- قم بتطهير ركائز PMMA مقاس 1 مم (الطبقات 1-3) ، والشريط على الوجهين (الطبقة 4) ، و PMMA من الدرجة البصرية 3 مم (الطبقة 5) باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 30 دقيقة قبل تجميع الرقاقة (الشكل 1 أ).
- قم بلصق ركائز PMMA مقاس 1 مم (الطبقات 1-3) على الدرجة البصرية 3 مم PMMA (الطبقة 5) بالشريط على الوجهين (الطبقة 4) لإكمال تجميع PMMA (الطبقات 1-5) (الشكل 1 أ).
- قم بإعداد زجاج الغطاء النظيف للتجميع على الشريحة.
- املأ مخففا بمقدار عشرة أضعاف من المنظف في وعاء تلطيخ (انظر جدول المواد) ، ونظف زجاج الغطاء في هذا المنظف باستخدام منظف بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة.
- اشطف جرة التلوين جيدا تحت ماء الصنبور الجاري لإزالة جميع آثار المنظف.
- استمر في الشطف بالماء المقطر لإزالة جميع آثار ماء الصنبور وكرر الخطوة 1.7.2 مرتين.
- جفف زجاج الغطاء النظيف عن طريق نفخه بغاز النيتروجين.
- قم بتطهير مجموعة PMMA (الطبقات 1-5) والشريط على الوجهين (الطبقة 6) وزجاج الغطاء (الطبقة 7) باستخدام الأشعة فوق البنفسجية داخل خزانة السلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة قبل تجميع الرقاقة (الشكل 1 أ).
- قم بلصق زجاج الغطاء النظيف (الطبقة 7) بمجموعة PMMA (الطبقات 1-5) بالشريط على الوجهين (الطبقة 6) (الشكل 1 أ).
- احتضان شريحة MOE في غرفة مفرغة طوال الليل ؛ استخدم مجموعة شريحة MOE للإجراءات اللاحقة (الشكل 3).
< p class = "jove_title" >
2. طلاء بولي إل ليسين (PLL) على الركيزة في مناطق زراعة الخلايا
- قم بإعداد أنبوب البولي تترافلورو إيثيلين ، والموصل ذو القاع المسطح ، والموصل المخروطي ، ومحول مخروطي لور ، وقابس أبيض محكم الإصبع (يسمى أيضا سدادة) ، ومحول لور ، وحقنة قفل لور ، وسدادة مطاطية سوداء (الشكل 4 أ ، جدول المواد). تعقيم جميع المكونات المذكورة أعلاه في الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- أغلق فتحات محولات جسر أجار (الشكل 1 أ) بسدادات بيضاء محكمة الإصبع. قم بتوصيل الموصل ذو القاع المسطح بمجموعة شريحة MOE عبر محولات المدخل والمخرج المتوسطة (الشكل 4 ب). قم بتوصيل محول المخروطي Luer بمحبس ثلاثي الاتجاهات.
- أضف 2 مل من محلول PLL 0.01٪ باستخدام حقنة سعة 3 مل تتصل بمحبس ثلاثي الاتجاهات للمدخل المتوسط (الشكل 4B-
).
- قم بتوصيل حقنة فارغة سعة 3 مل بمحبس ثلاثي الاتجاهات للمخرج المتوسط (الشكل 4B-
).
- املأ مناطق زراعة الخلايا بمحلول PLL. قم بضخ محلول الطلاء يدويا ذهابا وإيابا ببطء. أغلق محبتي التوقف ثلاثي الاتجاهات لإغلاق المحلول داخل مناطق الاستزراع.
- احتضان شريحة MOE عند 37 درجة مئوية طوال الليل في حاضنة مليئة بجوCO2 بنسبة 5٪.
< p class = "jove_title" >
3. إعداد شبكة جسر الملح
- باتباع الخطوة 2.6 ، افتح محبتي التوقف ثلاثي الاتجاهات وقم بإزالة الفقاعات في القنوات عن طريق ضخ محلول الطلاء يدويا ذهابا وإيابا في القناة باستخدام المحقنتين.
- ارسم 3 مل من الوسط الكامل (وسيط صيانة الخلايا الجذعية الذي يتكون من وسط النسر المعدل من Dulbecco / خليط مغذيات Ham F-12 (DMEM / F12) ، 2٪ مكمل B-27 ، 20 نانوغرام / مل EGF ، و 20 نانوغرام / مل bFGF) في حقنة سعة 3 مل تتصل بمحبس ثلاثي الاتجاهات للمدخل المتوسط (الشكل 4B- والشكل 4 ب-
).
- أضف 3 مل من الوسط الكامل لاستبدال محلول الطلاء في مناطق زراعة الخلايا. قم بتوصيل حقنة فارغة سعة 5 مل بمحبس ثلاثي الاتجاهات للمخرج المتوسط (الشكل 4B-
).
- تحضير شبكة جسر الملح (الشكل 5).
- قم بقص السدادة المطاطية السوداء لإنتاج فجوة وإدخال أقطاب الفضة (Ag) / كلوريد الفضة (AgCl) من خلال السدادة المطاطية السوداء وفي حقنة قفل Luer (الشكل 4 أ).
- استبدل القابس الأبيض المحكم بمحول Luer ، وقم بحقن 3٪ من الاغاروز الساخن لملء محول Luer.
ملاحظه: لتحضير الاغاروز الساخن ، قم بإذابة 3 جم من مسحوق الاغاروز في 100 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وتعقيمه في الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- قم بتوصيل حقنة قفل Luer بمحول Luer. حقن 3٪ من الاغاروز الساخن من خلال السدادة المطاطية السوداء لملء حقنة قفل لور باستخدام المحقنة بالإبرة. اترك من 10 إلى 20 دقيقة حتى يبرد الاغاروز ويتصمد.
ملاحظه: من أجل زيادة سعة حجم الاغاروز ، يتم تركيب حقنة قفل Luer على محول Luer (الشكل 4 والشكل 5). بعد ذلك ، يتم إدخال الأقطاب الكهربائية الكبيرة في حقنة قفل Luer. القطب قادر على توفير تحفيز كهربائي مستقر للتجربة طويلة المدى.
< p class = "jove_title" >
4. تحضير mNPCs
- استزراع mNPCs في وسط كامل في قارورة زراعة خلايا 25T عند 37 درجة مئوية في حاضنة مملوءة بجوCO2 بنسبة 5٪. الزراعة الفرعية للخلايا كل 3-4 أيام وإجراء جميع التجارب على الخلايا التي خضعت ل3-8 مقاطع من المصدر الأصلي.
- انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وقم بتدوير المجالات العصبية عند 100 × جم لمدة 5 دقائق. قم بتدوير المجالات العصبية عند 100 × جم لمدة 5 دقائق.
- استنشق 1x DPBS ثم أعد تعليق المجالات العصبية في الوسط الكامل. تخلط جيدا وبرفق.
- أضف 1 مل من تعليق الغلاف العصبي باستخدام حقنة سعة 1 مل تتصل بمحبس ثلاثي الاتجاهات للمخرج (الشكل 4B-).
فئة
5. إعداد نظام الموائع الدقيقة لتحفيز نبض التيار المستمر (الشكل 6)
- قم بتثبيت شريحة MOE المصنفة بالخلايا على سخان أكسيد الإنديوم والقصدير الشفاف (ITO) الذي يتم تثبيته على مرحلة آلية XYZ قابلة للبرمجة.
ملاحظه: يتم التحكم في درجة حرارة سطح ITO بواسطة وحدة تحكم مشتقة تناسبية متكاملة ويتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية. يتم تثبيت مزدوجة حرارية من النوع K بين الرقاقة وسخان ITO لمراقبة درجة حرارة مناطق زراعة الخلايا داخل الشريحة. يتم تثبيت شريحة MOE على مرحلة آلية قابلة للبرمجة XYZ وهي مناسبة للحصول على الصور بفاصل زمني تلقائي في أقسام القناة الفردية. تم وصف تصنيع سخان ITO وإعداد نظام تسخين ثقافة الخلايا سابقا.
- قم بغرس mNPCs عن طريق الضخ اليدوي في شريحة MOE عبر المخرج المتوسط. احتضان شريحة MOE المصنفة بالخلايا على سخان ITO 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
- بعد 4 ساعات ، قم بضخ الوسط الكامل عبر شريحة MOE عبر مدخل المتوسط بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / ساعة باستخدام مضخة حقنة.
ملاحظه: تزرع mNPCs وتحتفظ بها في الرقاقة لمدة 24 ساعة إضافية قبل تحفيز الحقول الكهربائية (EF) للسماح بارتباط الخلية ونموها. يتم جمع سائل النفايات في حقنة فارغة سعة 5 مل متصلة بمحبس 3 اتجاهات للمخرج ، كما هو موضح على أنه "نفايات" في الشكل 6 أ. يظهر تكوين نظام الموائع الدقيقة MOE في الشكل 6. يوفر نظام الموائع الدقيقة هذا إمدادا مستمرا بالتغذية للخلايا. يتم ضخ الوسط الطازج الكامل باستمرار في شريحة وزارة التربية والتعليم للحفاظ على قيمة ثابتة للأس الهيدروجيني. لذلك ، يمكن زراعة الخلايا خارج حاضنة ثاني أكسيد الكربون2.
- استخدم الأسلاك الكهربائية لتوصيل مضاعف EF بشريحة MOE عبر أقطاب Ag / AgCl الموجودة على الشريحة. قم بتوصيل مضاعف EF ومولد دالة بمكبر للصوت لإخراج نبضات تيار مستمر ذات موجة مربعة بحجم 300 مللي فولت/مم بتردد 100 هرتز عند دورات عمل ٪50 (50٪ وقت تشغيل و50٪ من وقت الإجازة) (الشكل 6 ب).
- قم بتوصيل الأسلاك الكهربائية بمضاعف EF. قم بتوصيل الأسلاك الكهربائية بشريحة MOE عبر أقطاب Ag / AgCl.
- قم بتوصيل مضاعف EF بمكبر الصوت باستخدام الأسلاك الكهربائية. قم بتوصيل مولد الوظائف بمكبر الصوت وراسم الذبذبات الرقمي.
ملاحظه: مضاعف EF عبارة عن دائرة تتضمن مقاومة غرفة الثقافة في الدائرة وتربط جميع الغرف الفردية في شبكة إلكترونية متوازية. يتم توصيل كل غرفة من غرف الاستزراع الثلاث كهربائيا بشكل تسلسلي بمقاوم متغير (Vr) ومقياس التيار الكهربائي (كما هو موضح في الشكل 6 أ) في مضاعف الإرسال. يختلف التيار الكهربائي عبر كل غرفة ثقافة عن طريق التحكم في الواقع الافتراضي ، ويظهر التيار على مقياس التيار الكهربائي المقابل. تم حساب شدة المجال الكهربائي في كل منطقة زراعة خلية بواسطة قانون أوم ، I = σEA ، حيث I هو التيار الكهربائي ، σ (تم تعيينه على أنه 1.38 S·m-1 ل DMEM / F12) هو التوصيل الكهربائي لوسط الاستزراع ، E هو المجال الكهربائي ، و A هي منطقة المقطع العرضي للغرفة الكهربائية. بالنسبة لبعد منطقة زراعة الخلية الموضح في الشكل 1 ، فإن التيار الكهربائي هو ~ 87 مللي أمبير و ~ 44 مللي أمبير لنبض التيار المستمر والتيار المستمر عند دورة عمل 50٪ ، على التوالي.
- قم بإخضاع mNPCs لنبضات تيار مستمر مربعة بحجم 300 مللي فولت / مم بتردد 100 هرتز لمدة 48 ساعة. ضخ الوسط الكامل باستمرار بمعدل 10 ميكرولتر / ساعة لتوفير التغذية الكافية للخلايا والحفاظ على قيمة الأس الهيدروجيني الثابتة في الوسط.
