مقالة منهجية

توليد العضيات الدماغية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Koch, L. S., et al. تصنيع الأنسجة القوية لثقافة طويلة الأجل من عضيات الدماغ المشتقة من iPSC لأبحاث الشيخوخة. J. Vis. Exp. (2023).

< p class = "jove_content">يوضح هذا الفيديو فحصا لتوليد عضيات دماغية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). يتم تحفيز iPSCs البشرية لتشكيل أجسام جنينية (EBs). يتم زراعة EBs فوق سقالة بوليمر باستخدام وسيط تحريضي ، مما يعزز التمايز إلى الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية والخلايا العصبية غير الناضجة. أخيرا ، يتم تضمين EBs في مصفوفة ونقلها إلى وسيط صيانة لتكوين العضيات الدماغية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

يوضح الشكل 1

نظرة عامة تخطيطية على سير عمل هذا البروتوكول.

< p class = "jove_title" >1. إعادة برمجة iPSC وصيانتها

  1. اجمع 8 مل من دم الشخص (المسنين أو المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين 65 عاما وما فوق) في أنابيب تحضير الخلية (CPT) مع سترات الصوديوم أو في حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) أو أنابيب الهيبارين.
  2. جهاز طرد مركزي عند 1,800 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لجمع الحبيبات التي تحتوي على الدم المحيطي فقط ولا تحتوي على مصل.
  3. استخدام ناقلات إعادة البرمجة المتخصصة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) للحصول على iPSCs.
  4. زراعة iPSCs في خالية من المغذيات, نازعة هيدروجين اللاكتوز رفع الفيروس (LDEV)-خال من عامل النمو مخفض, مصفوفة غشاء قاعدة مغلفة 6-آبار لوحات ثقافة في أساسي 8 (E8) وسائط (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  5. الحفاظ على iPSCs في وسائط E8 ل 3-4 أيام من أجل تجنب الاكتظاظ أو التمايز التلقائي.
  6. التحقق من صحة تعدد القدرات من خطوط iPSC باستخدام علامات الفلورسنت المناعي (الخطوة 2) واختبار الميكوبلازما (الخطوة 3).
< ص الفئة = "jove_title" >2. تلطيخ تعدد

القدرات
  1. للحفاظ على المحاليل والأجسام المضادة ، قم بزرع الخلايا على ألواح ثقافة مغلفة (الخطوة 1.4) مكونة من 24 بئرا قبل 3-4 أيام من التحليل. قم بشفط الوسط بماصة وقم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ من الفورمالديهايد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) لمدة 15-20 دقيقة في RT.
  2. اغسل الخلايا 3x باستخدام 1x PBS وتخلل 0.1٪ Triton-X 100 في ألبومين مصل البقر بنسبة 1٪ (BSA) في PBS لمدة 15 دقيقة على الأقل ، ولكن ليس أكثر من ساعة واحدة في RT.
  3. اغسل 3x مع 1x PBS وقم بالحظر باستخدام 5٪ BSA في PBS لمدة 30 دقيقة في RT.
  4. اغسل مرة أخرى 3x مع 1x PBS وأضف الأجسام المضادة Sox2 و Oct3/4 (تخفيف 1: 100 ؛ انظر جدول المواد) ، والبقع النووية DAPI في 1٪ BSA (1: 4,000 تخفيف) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. لفها بورق الألمنيوم للحماية من الضوء.
  5. اغسل 3x باستخدام 1x PBS واترك الخلايا في PBS. صورة بمجهر مضان بتكبير 10-20x. تأكد من أن علامات تعدد القدرات تحدد الجنس في المنطقة Y-box 2 (Sox2) وعامل نسخ ربط الأوكستامير 3/4 (Oct3 / 4) موضعية في نوى الخلايا.
< p class = "jove_title" >3. اختبار الميكوبلازما

ملاحظة: ارجع إلى بروتوكول مجموعة الكشف (راجع جدول المواد) للحصول على خطوات مفصلة لتنفيذ الفحص والتحليل. توفر مجموعة الكشف الكاشف والركيزة والمخزن المؤقت للفحص لاختبار الميكوبلازما.

  1. قبل تمرير الخلايا أو الوسط المنعش ، اجمع 2-3 مل من وسط زراعة الخلايا في أنبوب الطرد المركزي وحبيبات أي خلايا أو حطام عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في RT. قم بتخزين المادة الطافية عند 4 درجات مئوية لمدة ≤5 أيام. احتضان الخلايا بالوسط لمدة 24 ساعة على الأقل لضمان إشارة يمكن اكتشافها.
  2. أضف 100 ميكرولتر من المادة الطافية للخلية إلى أنبوب جديد أو بئر من صفيحة بيضاء الجدران ذات 96 بئرا (يوصى بالقاع غير الشفاف ، انظر جدول المواد). أعد تكوين الكاشف والركيزة في المخزن المؤقت للفحص وتوازن لمدة 15 دقيقة في RT.
  3. أضف 100 ميكرولتر من الكاشف إلى العينة واحتضنه لمدة 5 دقائق في RT. قم بقياس اللمعان باستخدام مقياس الإضاءة (القياس # 1).
  4. أضف 100 ميكرولتر من الركيزة إلى العينة واحتضن لمدة 10 دقائق في RT. قم بقياس اللمعان (القياس # 2).
  5. حدد تلوث الميكوبلازما بنسبة القياس # 2 إلى # 1. راجع دليل المجموعة لتفسير النتائج.
< p class = "jove_title" >4. تحضير الخيوط الدقيقة

  1. ابدأ في تحضير الخيوط الدقيقة بولي (حمض اللاكتيك كو جليكوليك) (PLGA ، انظر جدول المواد) عن طريق تآكل خيط الخياطة بالطرف الحاد للمشرط. تعقيم الألياف البالية برفق باستخدام 70٪ من الإيثانول.
  2. تحت المجهر وباستخدام المسطرة ، ابدأ في تقطيع ألياف PLGA إلى شرائح بطول 500 ميكرومتر إلى 1 مم. قطع حوالي 25 مم من الألياف في المجموع. احتفظ بالخيوط في أنبوب سعة 15 مل بمحلول مضاد حيوي ومضاد للفطريات سعة 1 مل.
    1. في غطاء المحرك ، قم بتخفيف محلول الألياف ب 10 مل من DMEM / F-12 (الجدول 1). دوامة جيدا لخلط المحلول.
      ملاحظه: العمل في غطاء تدفق مزرعة الخلايا في بيئة معقمة.
  3. أضف 20 ميكرولتر من محلول الألياف إلى ثلاثة أجسام جنينية (EB) تشكل آبارا من صفيحة مكونة من 96 بئرا. تحت الفحص المجهري الساطع ، قم بحساب ومتوسط الألياف لكل بئر. تمييع أو تركيز إلى متوسط 5-10 خيوط دقيقة PLGA لكل بئر. تحضير كل بئر بهذه الطريقة.
  4. الآبار جاهزة الآن للزرع بالخلايا. قم بتخزين الطبق في درجة حرارة الغرفة لحين الحاجة أو عند 4 درجات مئوية لليوم التالي.
< p class = "jove_title" >5. تكوين الجسم الجنيني (EB)

ملاحظة: يجب تسخين جميع الوسائط والحلول إلى RT.

  1. بمجرد أن تصل iPSCs إلى 70٪-80٪ التقاء (الشكل 2A), تكون جاهزة ليتم تمريرها واستخدامها لتشكيل EB. افحص الخلايا بالمجهر بتكبير 10x-20x. تأكد من أن المستعمرات تعرض الحد الأدنى (<10٪) من مناطق التمايز التلقائي.
  2. استنشق الوسط بماصة واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco. قم بفصل المستعمرات عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من محلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) أو 0.5 ملي مولار من EDTA واحتضانها لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية < / > ملاحظه: العمل في غطاء تدفق مزرعة الخلايا في بيئة معقمة.
  3. اجمع الخلايا المنبعثة عن طريق إضافة 1 مل من وسائط E8 الطازجة إلى كل بئر والماصة برفق حتى يتم فصل جميع الخلايا.
  4. انقل 1.5 مل من تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل ، وأضف 1 مل أخرى من وسائط E8 الطازجة للوصول إلى الحجم الإجمالي 2.5 مل.
  5. جهاز طرد مركزي عند 290 × جم لمدة 3 دقائق في RT.
  6. قم بشفط المادة الطافية بماصة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسائط Essential 6 (E6 ، انظر جدول المواد) المكملة بمثبط بروتين كيناز (ROCK) المرتبط ب 50 ميكرومتر ، واحسب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
  7. قم بإعداد معلق خلوي من 60,000-90,000 خلية / مل ، اعتمادا على كثافة البذر المطلوبة ، في وسائط E6 مكملة ب 50 ميكرومتر من مثبطات ROCK (انظر جدول المواد).
  8. أضف 150 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة التعلق المنخفضة جدا (ULA) المكونة من 96 بئرا (أو صفيحة مقعرة مجهزة). بذور 9,000-11,000 خلية لكل بئر.
  9. قم بالطرد المركزي لتجميع الخلايا بالقوة عند 290 × جم لمدة 1 دقيقة في RT. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
< p class = "jove_title" >6. تحريض الظهارة العصبية

  1. بعد 24 ساعة، قم بسحب 120 ميكرولتر من الوسائط بعناية باستخدام ماصة. تأكد من عدم شفط EB عن طريق خفض طرف الماصة بعيدا جدا في البئر.
  2. أضف 150 ميكرولتر من وسائط E6 (في RT) مكملة ب 2 ميكرومتر من XAV939 ومثبطات الأمهات ضد مثبطات الشلل العشري الخماسي (SMAD): 10 ميكرومتر من SB431542 و 500 نانومتر من 193189 LDN لكل بئر (انظر جدول المواد).
  3. قم بتغيير الوسط يوميا باستخدام وسائط E6 المعدة حديثا مع 2 ميكرومتر من XAV939 و 10 ميكرومتر من SB431542 و 500 نانومتر من LDN 193189.
    ملاحظه: بحلول اليوم 6 (DIV6) ، يجب أن يكون قطر EBs 550-600 ميكرومتر وأن تكون جاهزة لمزيد من التمايز.
< p class = "jove_title" >7. التمايز العضوي والنضج

ملاحظة: يجب تسخين جميع الوسائط إلى RT.

  1. عند DIV7 تقريبا ، تحقق مما إذا كانت جميع EBs قد وصلت إلى قطر 550-600 ميكرومتر واعرض حافة ناعمة وواضحة (الشكل 2 ب) ؛ في هذه المرحلة ، تكون جاهزة للتضمين في مصفوفة خارج الخلية (ECM).
    ملاحظه: العمل في بيئة معقمة.
  2. قم بإعداد صفائح التضمين المدملة من فيلم الختم بالحرارة (انظر جدول المواد) عن طريق وضع ورقة فيلم (طولها حوالي 4 بوصات) على صندوق P200 فارغ. باستخدام أنبوب مخروطي 15 مل أو أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 500 ميكرولتر ، اضغط برفق على ورقة الفيلم في الثقوب لعمل 12 غمازات. رش لوح الفيلم بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركه يجف داخل غطاء التدفق مع تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  3. قم بإذابة كمية كافية من مصفوفة الغشاء القاعدي (Matrigel ، انظر جدول المواد) على الجليد وضعها داخل غطاء التدفق.
    ملاحظه: لكل EB ، هناك حاجة إلى ما يقرب من 30 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء غير المخففة. احتفظ دائما بمصفوفة الغشاء أقل من 4 درجات مئوية لمنعها من التبلور. يوصى أيضا باستخدام أطراف الماصة المبردة مسبقا لأنها تبطئ المصفوفة من البلمرة في الطرف أثناء سحب العينات، وبالتالي تقليل فقد المواد.
  4. باستخدام طرف P200 عريض التجويف، انقل EB واحد إلى كل غمازة، وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسائط باستخدام طرف ماصة عادي. ضع في اعتبارك عدم ترك EBs يجف. باستخدام طرف P200 العادي ، أضف ~ 30 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء غير المخففة إلى كل عضو عضوي ، مع التأكد من أن EB في مركز القطرة.
  5. بمجرد تضمين جميع EBs في المصفوفة ، ضع ورقة الفيلم التي تحتوي على EBs في طبق بتري معقم.
    ملاحظه: اختياريا ، يمكن وضع طبق بتري صغير مملوء بالماء المعقم في طبق بتري الأكبر بجوار ورقة الفيلم لمنع التبخر.
    1. انقل الطبق إلى حاضنة واحتضنه عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 10 دقائق تقريبا للسماح لمصفوفة الغشاء بالتصلب.
  6. لكل مجموعة من 12 عضوية مدمجة ، قم بإعداد 5 مل من وسائط التمايز مع B27 بدون فيتامين أ (الجدول 1) في بئر واحد من لوحة ULA 6 آبار. قم بتسخين الطبق مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حاضنة.
  7. بمجرد انتهاء وقت الحضانة ، انقل EBs المضمنة إلى لوحة ULA المكونة من 6 آبار عن طريق أخذ ورقة الفيلم ودفع الدمامل للخارج من الجزء الخلفي من الورقة. إذا لزم الأمر ، خذ 1 مل من البئر وقم بتثبيتها على الورقة لمساعدة القطرات على الانفصال عن الفيلم.
    ملاحظه: يمكن رؤية التغييرات المورفولوجية المهمة بعد يوم واحد من التضمين ؛ تنتقل EBs من وجود حواف ناعمة إلى نتوءات منتفخة تشكل براعم (الشكل 2 ج).
  8. بعد يومين (DIV9) ، قم بإجراء تغيير نصف الوسائط. احرص على عدم شفط أو إتلاف قطرات مصفوفة الغشاء في هذه العملية.
  9. بعد يومين آخرين (DIV11) ، قم بإجراء تغيير كامل للوسائط ، واستكمال الوسائط ب 3 ميكرومتر من CHIR99021 (انظر جدول المواد).
  10. في DIV14 ، قم بتغيير الوسائط إلى وسائط التمايز مع B27 مع فيتامين A (الجدول 1) لزيادة تدريجية في حجم العضوية.
  11. في DIV16 ، ضع لوحة البئر على شاكر مداري بسرعة 90 دورة في الدقيقة داخل حاضنة. قم بتغيير الوسائط كل يومين.
  12. كل 40 DIV ، قم بتخفيف 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء لكل 50 مل من الوسائط للحصول على مغذيات إضافية في الوسائط.
< p class = "jove_content" >الجدول 1: تكوين وسائط التمايز المستخدمة في هذه الدراسة.

الكاشف التركيز النهائي الحجم (إجمالي 50 مل) DMEM-F12 50٪ 25 مل الوسط العصبي القاعدي 50٪ 25 مل ملحق N2 (100x) 1x 0.25 مل مكمل B27 -/+ فيتامين أ (50x) 0.5 ضعف 0.5 مل إنسولين 0.25٪ 12.5 ميكرولتر جلوتا ماكس (100x) 1x 0.5 مل MEM-NEAA (100x) 0.5 ضعف 0.25 مل هيبس (1 م) 10 ملم 0.5 مل مضاد حيوي / مضاد للفطريات (100x) 1x 0.5 مل 2-β-ميركابتو إيثانول 50 ميكرومتر 17.5 ميكرولتر ملاحظة: بعض DMEM-F12 يحتوي بالفعل على GlutaMAX ، ولا حاجة لإضافة إضافية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي لسير العمل والجدول الزمني لهذه الطريقة.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-2
الشكل 2: تمايز ونضج العضيات الدماغية. (أ) صورة تمثيلية لثقافة iPSC عند 70٪-80٪ التقاء. (ب) تم إنشاء الأجسام الجنينية (EBs) وتم تحفيز تك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2-β-ميركابتو إيثانول ثيرمو فيشر العلمي 31350010 4 ′ ، 6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) إنفيتروجين د1306 67:40:00 6-well واضحة مسطحة القاع CELLSTAR خلية ثقافة لوحة متعددة الآبار غرينر بيو ون 657185 6-Well Clear Flat Bottom Ultra-Low مرفق لوحة جيدة كورنينج 3471 96-well واضح جولة القاع فائقة المنخفضة المرفق Microplate كورنينج 7007 96-Well ، Nunclon دلتا المعالجة ، صفيحة مسطحة القاع ثيرمو فيشر العلمي 136101 أكوتاز سيجما ألدريتش 46964 حل انفصال الخلايا مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x) جيبكو 15240062 سيتوفر B27 (مع فيتامين أ) (50x) جيبكو 17504044 مكمل فيتامين ب 27 (ناقص فيتامين أ) (50 ضعفا) جيبكو 12587010 أنابيب تحضير الخلايا أحادية النواة الزجاجية BD Vacutainer™ (CPT) ثيرمو فيشر العلمي 02-685-125 ألبومين مصل الأبقار سيجما ألدريتش أ 9418 الطرد المركزي إيبندورف 5810 ص مع حاملي اللوحات CHIR99021 سيليك للكيماويات S2924 CytoTune Sendai إعادة برمجة ناقلات ثيرمو فيشر العلمي A1378001 بادئات ddPCR | بشرية | مابت بيو راد dHsaCPE192234 بادئات ddPCR | بشرية | RBFOX3 (نيون) بيو راد دهاساCPE5052108 DMEM / F12 ثيرمو فيشر العلمي 11320074 دبل كورتين (DCX) سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية SC-8066 09:20 محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) ثيرمو فيشر العلمي 14190144 خال من الكالسيوم ولا المغنيسيوم أكواب إيبندورف ، 1.5 مل إيبندورف 0030 125.215 أساسي 6 جيبكو A1516401 أساسي 8 جيبكو A1517001 حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) إنفيتروجين 15575020 أنابيب الصقر، 15 مل، مخروطية الشكل غرينر بيو ون 188271-ن فورمالدهيد سيجما ألدريتش 252549 محلول مخزون بنسبة 37٪ ، مخفف إلى 4٪ في PBS Geltrex LDEV خالية من عامل النمو المخفضة مصفوفة الغشاء القاعدي ثيرمو فيشر العلمي A1413202 جلوتا ماكس (100x) جيبكو 35050038 عداد خلايا مقياس الدم هوسر العلمية 1490 عازلة HEPES ثيرمو فيشر العلمي 15-630-080 إنسولين سيجما ألدريتش I9278 LDN 193189 تقنيات الخلايا الجذعية 72147 الخريطة 2 أبكام أب32454 04:20 مصفوفة غشاء أساسي لعامل النمو المخفض (GFR) ، خالية من LDEV كورنينج 356230 مصفوفة غشاء القاعدي محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM-(MEM-NEAA ؛ 100x) ثيرمو فيشر العلمي 11140050 متعدد التسميات عداد فيكتور 3 قارئ لوحة بيركين إلمر 1420 مقياس الإضاءة طقم الكشف عن الميكوبلازما MycoAlert لونزا LT07-318 ملحق N-2 (100x) ثيرمو فيشر العلمي 17502-048 نيو ميليبور MAB377 09:20 الوسط العصبي القاعدي ثيرمو فيشر العلمي 21103049 Oct-3/4 الجسم المضاد (C-10) Alexa Fluor 647 سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية SC-5279 AF647 02:40 بارافيلم بيميس PM-996 ورقة فيلم لدن بالحرارة PAX6 ثيرمو فيشر العلمي 42-6600 04:20 البنسلين / الستربتومايسين جيبكو 15070063 الخيوط الدقيقة بولي (حمض اللاكتيك كو جليكوليك) (PLGA) إيثيكون J463 نظام PCR الرقمي QX200 Droplet بيو راد 1864001 مثبط الصخور (Y27632) سيليك للكيماويات S1049 SB431542 أنظمة البحث والتطوير 1614/50 SOX2 الأجسام المضادة أحادية النسيلة (Btjce) ، Alexa Fluor 488 ، eBioscience إنفيتروجين 53-9811-80 02:40 Synapsin I (SYN) كالبيوكيم 574777 04:20 تريتون-اكس 100 سيجما ألدريتش تي 8787 TUJ1 سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية SC-80005 بيتا 3 توبولين ؛ 1: 500 XAV939 توكريس بيوساينس 3748

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة