توليد الوصلات العصبية العضلية باستخدام جهاز الموائع الدقيقة

الملخص

المصدر: Stoklund Dittlau ، K. et al. ، جيل الوحدات الحركية البشرية ذات الوصلات العصبية العضلية الوظيفية في أجهزة الموائع الدقيقة.J. Vis. Exp. (2021)

يوضح الفيديو تكوين الوصلات العصبية العضلية باستخدام جهاز ميكروفلويديك. يتم زرع الخلايا السليفة العصبية والخلايا السلفية العضلية في آبار مختلفة داخل الجهاز وتترك لتنضج في الخلايا العصبية الحركية والأنابيب العضلية ، على التوالي. يؤدي إنشاء حجم وتدرج كيميائي إلى تطوير الوصلات العصبية العضلية النشطة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

جميع الكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد ويجب استخدامها معقمة. يجب تسخين الوسائط إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام ما لم ينص على خلاف ذلك. للحصول على نظرة عامة على بروتوكول الثقافة المشتركة ، يرجى الاطلاع على الشكل 1.

< ص الفئة = "jove_title">1. تمايز أسلاف الخلايا العصبية الحركية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs)

1. اتبع بروتوكول تمايز الخلايا العصبية الحركية ، المقتبس من دراسة سابقة ، حتى الوصول إلى حالة السلف العصبي في اليوم 10 (NPCs). وفقا للإطار الزمني للبروتوكول ، يبدأ التمايز يوم الاثنين (اليوم 0) ، مما ينتج عنه اليوم 10 الشخصيات غير القابلة للعب يوم الخميس.
2. Cryopreserve day 10 NPCs في استبدال المصل بالضربة القاضية ب 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) بكثافة 2 × 10^6-4 × 10⁶ خلايا لكل قارورة.
   أنذر: DMSO سام: مقبض في غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية.
   ملاحظة: من المتوقع أن تكون ما يقرب من 50٪ من اليوم 10 غير قابلة للعب حيوية عند الذوبان. أوقف بروتوكول تمايز الخلايا العصبية الحركية في حالة "اليوم 10 NPC" وحافظ على الشخصيات غير القابلة للعب بالتبريد لتوليد عدد كبير من الشخصيات غير القابلة للعب ، والتي يمكن تخزينها واستخدامها لاحقا ، مما يقلل من طول الجدول الزمني الإجمالي لبروتوكول الزراعة المشتركة من 28 يوما إلى 19 يوما إجمالا.

< p class = "jove_title" >2. اشتقاق وصيانة الأرومة المتوسطة البشرية (MABs)

ملاحظة: MABs هي خلايا جذعية وسيطة مرتبطة بالأوعية الدموية ، والتي تم حصادها في هذه الحالة من الخزعات التي تم الحصول عليها من متبرع سليم يبلغ من العمر 58 عاما. تتوفر مصادر تجارية بديلة. يتم شرح بروتوكول الحصول على MABs بإيجاز. لمزيد من المعلومات ، راجع البروتوكول التفصيلي. يجب تسخين جميع وسائط MAB إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.

1. افرم أنسجة الخزعة واحتضن أطباق الكولاجين (من جلد العجل) المغلفة بحجم 6 سم في وسط نمو (الجدول 1) لمدة أسبوعين. قم بتغيير الوسيط كل 4 أيام.
   1. لتحضير طلاء الكولاجين ، قم بإذابة 100 مجم من الكولاجين في 20 مل من 0.1 مل من حمض الخليك. يستغرق الكولاجين وقتا حتى يذوب ، لذا ضع الخليط على منصة هزاز طوال الليل في RT. في اليوم التالي ، قم بتعبئة 80 مل من ddH₂O إلى حجم نهائي يبلغ 100 مل.
      أنذر: حمض الخليك سام. مقبض في غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية.
      ملاحظه: يمكن إعادة استخدام الكولاجين من طلاء جلد العجل حتى 5 أضعاف. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   2. قم بتغطية سطح الطبق بالكامل أو القارورة بالكولاجين ، وأغلقها واحتضانها لمدة 20 دقيقة في RT داخل تدفق رقائقي. بعد 20 دقيقة ، استرجع الكولاجين في وعاء جديد ، وأغلق الطبق / القارورة الفارغة واتركه لمدة 10 دقائق في RT في التدفق الرقائقي.
   3. انقل الطبق / القارورة إلى الحاضنة لمدة حضانة طوال الليل (أو 6 ساعات على الأقل) (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂). اغسل 5 مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم (DPBS) قبل طلاء الخلايا.
2. بعد 14 يوما ، يقوم FACS (فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت) بفرز MABs للفوسفاتيز القلوي البشري متبوعا بمزيد من التوسع. حافظ على MABs على قوارير T75 المطلية بالكولاجين في وسط النمو وقم بتغيير وسط النمو كل يومين (10 مل لكل قارورة).
3. حفظ أو مرور أو بذور MABs في الأجهزة عند الوصول إلى 70٪ من التقاء.
   ملاحظه: تفقد MABs إمكاناتها العضلية بسبب الاندماج التلقائي عند ملامسة خلية إلى خلية. تأكد من عدم تجاوز 70٪ التقاء عند توسيع MABs. تحتوي قارورة T75 المتجمعة بنسبة 70٪ على ما يقرب من 600,000-800,000 خلية ، والتي يمكن حفظها بالتبريد عند 100,000 خلية لكل قارورة. يمكن لاحقا إذابة كل قارورة وبذرها في قارورة T75 للتوسع.
4. لتمرير MABs ، اغسلها برفق مرة واحدة باستخدام 7 مل من DPBS ثم احتضانها في 7 مل من محلول تفكك MAB لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ لفصل الخلايا.
   1. قم بتحييد محلول تفكك MAB باستخدام 7 مل من وسط النمو ، وكشط الخلايا برفق ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. اغسل القارورة برفق ب 5 مل إضافية من وسط النمو لجمع MABs المتبقية.
   2. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 3 دقائق عند 300 × جم ، ثم انتقل مباشرة إلى قارورة T75 جديدة مطلية بالكولاجين للتوسع ، أو الحفظ بالتبريد في استبدال المصل بالضربة القاضية مع 10٪ DMSO أو عد البذور في جهاز ميكروفلويديك.
      ملاحظة: يتم إجراء الممرات 1x-2x في الأسبوع لتوسيع الخلية حتى الحد الأقصى لعدد الممر 13. عند التفكك ، تظهر MABs كروية وكبيرة الشكل عند فحصها تحت المجهر.

فئة

3. تحضير أجهزة الموائع الدقيقة المجمعة مسبقا - اليوم 9

ملاحظة: تم تكييف البروتوكول من بروتوكول جهاز الخلايا العصبية الخاص بالشركة المصنعة للجهاز microfluidic وقد تم تعديله لاستخدام كل من الأجهزة المجمعة مسبقا وأجهزة السيليكون. هنا ، يتم استخدام الأجهزة المجمعة مسبقا لكيمياء الخلايا المناعية (ICC) وتسجيلات الكالسيوم العابرة للخلايا الحية ، بينما تستخدم أجهزة السيليكون لمسح المجهر الإلكتروني (SEM). يتبع الجدول الزمني للبروتوكول الجدول الزمني لبروتوكول تمايز الخلايا العصبية الحركية.

1. قم بإعداد أجهزة الموائع الدقيقة في اليوم السابق لبذر الخلايا ، حيث يحتاج الطلاء إلى الحضانة طوال الليل. وفقا لبروتوكول الخلايا العصبية الحركية ، سيكون هذا يوم الأربعاء. أضف ~ 10 مل من 70٪ -100٪ إيثانول إلى طبق بتري مقاس 10 سم. استخدم الملقط لنقل الجهاز من حاوية الشحن إلى طبق بتري للتعقيم.
2. اغمر الجهاز في الإيثانول لمدة 10 ثوان وانقل الجهاز بالملقط إلى قطعة من الورق ليجف في الهواء في التدفق الصفحي لمدة ~ 30 دقيقة. اقلب الجهاز عدة مرات للسماح لكلا الجانبين بالجفاف. عندما يجف الجهاز ، استخدم الملقط لنقل كل جهاز إلى طبق بتري فردي مقاس 10 سم لسهولة التعامل معه. < / > أنذر: الإيثانول سام. مقبض في غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية
3. قم بتغطية الجهاز ب Poly-L-ornithine (PLO) (100 ميكروغرام / مل) في DPBS واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ لمدة 3 ساعات.
   1. استخدم ماصة P200 لإضافة 100 ميكرولتر من PLO في DPBS في بئر علوي بالقرب من فتحة القناة قدر الإمكان ومراقبة مرور السائل من البئر العلوي عبر القناة إلى البئر السفلي. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من PLO في DPBS إلى البئر السفلي.
   2. كرر على الجانب الآخر من الأخاديد الدقيقة وانتهي بإضافة 100 ميكرولتر على جانب واحد من الجهاز لإنشاء تدرج حجم بين جانبي الجهاز المعكوسين لتغطية الأخاديد الدقيقة (على سبيل المثال ، الجانب الأيمن 200 ميكرولتر ، الجانب الأيسر 300 ميكرولتر). بعد 3 ساعات ، اغسل الجهاز 3 مرات لمدة 5 دقائق باستخدام DPBS. استخدم نظام شفط إذا لزم الأمر.
      ملاحظه: تأكد من تجنب أي تكوين فقاعة هواء في القنوات في أي وقت أثناء طلاء الخلايا أو زراعتها. حتى الفقاعات الصغيرة سوف تتوسع خلال فترة زمنية قصيرة ، مما يمنع الطلاء أو بذر الخلايا أو تدفق الوسائط عبر القناة. إذا توقف السائل في القناة أثناء الطلاء ، فقم بإعادة تعليق محلول PLO مباشرة في القناة من كلا الجانبين. إذا كانت الفقاعات لا تزال موجودة ، فاستخدم 200 ميكرولتر من DPBS لشطف القناة وكرر عملية الطلاء كما هو مذكور أعلاه في الخطوات 3.3.1-3.3.2. إذا ظهرت فقاعات بعد بذر الخلايا ، فمن المستحيل استعادة الجهاز ، لأن تنظيف القناة سيؤدي إلى إتلاف الخلايا.
4. قم بتغطية الجهاز بمادة اللامينين (20 ميكروغرام / مل) في وسط عصبي القاعدي واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. اتبع نفس التعليمات الخاصة بطلاء منظمة التحرير الفلسطينية من الخطوات 3.3.1-3.3.2.
5. في اليوم التالي ، استخدم ماصة P200 وضع الطرف في البئر المقابل لفتحة القناة لإزالة طلاء اللامينين من الآبار. أضف DPBS إلى جميع الآبار واترك الأجهزة التي تحتوي على DPBS في التدفق الرقائقي عند RT لتلقيح الخلايا.
   ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، من المهم عدم إزالة السائل (طلاء اللامينين ، DPBS ، الوسائط ، محلول التثبيت ، إلخ) مباشرة من القنوات ، لأن ذلك قد يتسبب في تكوين فقاعة هواء. افحص دائما الأجهزة تحت المجهر قبل بذر الخلايا.

فئة

4. طلاء الشخصيات غير القابلة للعب في أجهزة الموائع الدقيقة - اليوم 10

ملاحظة: وفقا لبروتوكول تمايز الخلايا العصبية الحركية ، يحدث طلاء اليوم 10 من الشخصيات غير القابلة للعب يوم الخميس.

1. استخدم اليوم 10 غير القابلة للعب المنفصلة حديثا ، أو قم بإذابة 1-2 قارورة من NPCs المخزنة لكل 10 مل من وسط الخلايا العصبية الحركية في اليوم 10 (الجدول 2 والجدول 3) مع محلول مثبط ROCK (10 ميكرولتر / مل) ، وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 100 × جم لمدة 4 دقائق.
2. أعد تعليق حبيبات الخلية في 500-1000 ميكرولتر من وسط الخلايا العصبية الحركية في اليوم 10 باستخدام محلول مثبط ROCK (10 ميكرولتر / مل) وعد الخلايا الحية باستخدام أي طريقة عد مفضلة. < / > ملاحظه: كما هو مذكور أدناه ، تأكد من تعليق الشخصيات غير القابلة للعب في الكمية الصحيحة من الوسائط لاستيعاب حجم البذر الأمثل.
3. قم بإزالة DPBS من بئرين على جانب واحد من الأخاديد الدقيقة في الجهاز باستخدام ماصة P200 وبذرة 250,000 NPCs لكل جهاز في 60-100 ميكرولتر من وسائط الخلايا العصبية الحركية في اليوم 10.
   1. في البئر العلوي الأيمن ، قم بزرع 30-50 ميكرولتر من تعليق الخلية (125,000 خلية) بالقرب من فتحة القناة بزاوية 45 درجة واسحب السائل المتبقي برفق على طول أرضية البئر باتجاه مركز البئر بطرف الماصة.
   2. توقف مؤقتا لبضع ثوان للسماح لتعليق الخلية بالتدفق عبر القناة قبل تكرار ذلك في البئر السفلي (125,000 خلية في 30-50 ميكرولتر). استخدم قلما لتمييز الجانب المصنف "NPC" أو ما يعادله لسهولة توجيه الجهاز بدون مجهر.
   3. احتضان الجهاز عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 5 دقائق للسماح بربط الخلية قبل تعبئة الآبار ذات البذرتين بوسط خلية عصبية حركية إضافية ليوم 10 (إجمالي 200 ميكرولتر / بئر) واحتضانها مرة أخرى عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
      ملاحظه: يمكن أن يحتوي كل بئر على 200 ميكرولتر ، وتضمن خلايا البذر في كل من الآبار والقنوات بنية قوية للثقافة ، مما يقلل من خطر انفصال الخلايا أثناء تغيرات الوسائط. من الممكن زرع عدد أقل من الخلايا في القناة فقط. ومع ذلك ، سيجعل هذا الثقافة أكثر عرضة للتيار الصوتي عبر القنوات أثناء كل تغيير متوسط.
4. استخدم ماصة P200 لإزالة DPBS من البئرين على الجانب الآخر من الأخاديد الدقيقة المقابلة لشخصيات غير قابلة للعب المصنفة حديثا. أضف 200 ميكرولتر / بئر من وسائط الخلايا العصبية الحركية في اليوم 10 وانتظر بضع ثوان بين البئر العلوي والسفلي للسماح للوسائط بالتدفق عبر القناة. بعد ذلك ، أضف 6 مل من DPBS لكل طبق 10 سم حول الجهاز لمنع تبخر الوسط أثناء الحضانة.
   ملاحظه: أضف DPBS إضافيا حول الجهاز خلال فترة الثقافة إذا لزم الأمر.
5. قم بإجراء تغيير كامل في وسط الخلايا العصبية الحركية في كلا الجزأين من الجهاز في اليوم 11 (الجمعة) واليوم 14 (الاثنين) واليوم 16 (الأربعاء) (الجدول 2 والجدول 3). أضف مكملات وسائط جديدة في يوم التغيير المتوسط.
   ملاحظه: من هذه النقطة فصاعدا، قم بإجراء جميع التغييرات المتوسطة باستخدام ماصة P200. ضع طرف الماصة دائما بعيدا عن القناة عند حافة البئر ولا تقم بإزالة السائل مباشرة من القناة. احرص على عدم فصل أجهزة السيليكون. يجب أن تتم إزالة الوسيط وإضافته ببطء لمنع انفصال الخلايا.
   1. قم بإزالة جميع الوسائط الموجودة في كلا البئرين اللذين تحتوي على NPCs بعناية عن طريق وضع طرف الماصة P200 عند الحافة السفلية لجدار البئر مقابل فتحة القناة. أضف ببطء 50-100 ميكرولتر من وسط الخلايا العصبية الحركية الجديدة إلى البئر العلوي عن طريق وضع طرف الماصة P200 على الحافة العلوية لجدار البئر مقابل فتحة القناة.
   2. توقف مؤقتا لبضع ثوان للسماح للوسط بالتدفق عبر القناة قبل إضافة 50-100 ميكرولتر من وسط الخلايا العصبية الحركية إلى أسفل البئر. كرر هذه العملية بعناية حتى يحتوي كلا البئرين على 200 ميكرولتر / بئر. كرر على الجانب بدون خلايا.

فئة

5. طلاء MAB في أجهزة الموائع الدقيقة - اليوم 17

1. قبل حوالي 7 أيام من بذر MABs في أجهزة الموائع الدقيقة (اليوم 10 من تمايز الخلايا العصبية الحركية) ، قم بإذابة MABs وبذرها في وسط النمو (الجدول 1) في قارورة T75 المغلفة بالكولاجين للسماح بتوسيع الخلايا بشكل كاف. انظر القسم 2.
2. في اليوم 17 من تمايز الخلايا العصبية الحركية (الخميس) ، قم بفصل MABs كما هو موضح في الخطوة 2.4 ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في ~ 500 ميكرولتر من وسط النمو وعد الخلايا الحية باستخدام أي طريقة عد مفضلة. < / > ملاحظه: كما هو مذكور أدناه ، تأكد من إعادة تعليق MABs في الكمية الصحيحة من الوسائط لاستيعاب حجم البذر الأمثل.
3. قم بإزالة وسط الخلايا العصبية الحركية على الجانب غير المزروع من الأخاديد الدقيقة في الجهاز باستخدام ماصة P200 ، واغسلها برفق باستخدام DPBS ، وقم بزرع 200,000 MAB لكل جهاز في 60-100 ميكرولتر من وسط النمو.
   1. في البئر العلوي الأيمن ، قم بزرع 30-50 ميكرولتر من تعليق الخلية (100,000 خلية) بالقرب من فتحة القناة بزاوية 45 درجة واسحب السائل المتبقي برفق على طول أرضية البئر باتجاه مركز البئر بطرف الماصة. توقف مؤقتا لبضع ثوان للسماح بتدفق الخلايا عبر القناة قبل التكرار في البئر السفلي (100,000 خلية في 30-50 ميكرولتر).
   2. احتضان الجهاز عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 5 دقائق للسماح بربط الخلية قبل ملء البئرين الطازجين بذرة MAB بوسط نمو إضافي (إجمالي 200 ميكرولتر / بئر). احتضن مرة أخرى عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
      ملاحظة: ليست هناك حاجة إلى تغيير متوسط في اليوم 17 على جانب الخلايا العصبية الحركية من الجهاز. يتم إجراء التغيير المتوسط في اليوم 17 وفقا لطريقة تمايز الخلايا العصبية الحركية المنشورة سابقا بدلا من ذلك في اليوم 18 (الجمعة).

فئة

6. تنفيذ تدرج حجمي وكيميائي لتعزيز نمو الخلايا العصبية الحركية نحو حجرة MAB

1. في اليوم 18 ، قم بإجراء تغيير متوسط كامل على جانب الخلايا العصبية الحركية مع وسط الخلايا العصبية الحركية في اليوم 18 (200 ميكرولتر / بئر). اتبع التعليمات الخاصة بالتغييرات المتوسطة المذكورة في الخطوات 4.5.1-4.5.2. بدء تمايز MAB في حجرة MAB للجهاز (الجدول 2 والجدول 4).
   1. اغسل مقصورات MAB بعناية مرة واحدة باستخدام DPBS قبل إضافة وسط تمايز MAB المسخن مسبقا (الجدول 4) مع 0.01 ميكروغرام / مل من الأجرين البشري (200 ميكرولتر / بئر). < / > ملاحظه: سوف تندمج MABs وتشكل الأنابيب العضلية متعددة النوى على مدار أسبوع واحد.
2. في اليوم 21 ، وفقا لبروتوكول تمايز الخلايا العصبية الحركية (الاثنين) ، ابدأ التدرج الكيميائي والحجمي (الجدول 2 والجدول 3).
   1. أضف 200 ميكرولتر / بئر من الوسط القاعدي للخلايا العصبية الحركية مع 30 نانوغرام / مل من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) ، وعامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF) وعامل التغذية العصبية الهدبي (CNTF) ، واللامينين البشري (0.01 ميكروغرام / مل) ، واللامينين (20 ميكروغرام / مل) إلى حجرة الأنبوب العضلي (التي تم تعريفها سابقا باسم حجرة MAB). أضف الوسط القاعدي للخلايا العصبية الحركية (100 ميكرولتر / بئر) بدون عوامل نمو إلى حجرة الخلايا العصبية الحركية.

الجدول 1: وسط نمو MAB.يمكن أن يستمر المتوسط لمدة أسبوعين عند 4 درجات مئوية. يضاف bFGF طازجا في يوم الاستخدام.

الكاشف تركيز المخزون التركيز النهائي IMDM 1x 80٪ مصل الأبقار الجنينية 15٪ البنسلين / الستربتومايسين 5000 وحدة / مل 0.5٪ ل-جلوتامين 50 ضعفا 1٪ بيروفات الصوديوم 100 ملم 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية 100 ضعف 1٪ ترانسفيرين الأنسولين السيلينيوم 100 ضعف 1٪ bFGF (مضاف طازجا) 50 ميكروغرام / مل 5 نانوغرام / مل

الجدول 2: الوسط القاعدي للخلايا العصبية الحركية.يمكن أن يستمر المتوسط 4 أسابيع عند 4 درجات مئوية.

الكاشف تركيز المخزون التركيز النهائي DMEM / F12 50٪ الوسط العصبي القاعدي 50٪ البنسلين / الستربتومايسين 5000 وحدة / مل 1٪ ل-جلوتامين 50 ضعفا 0.5 ٪ مكمل N-2 100 ضعف 1٪ ب 27 بدون فيتامين أ 50 ضعفا 2٪ β ميركابتو إيثانول 50 ملم 0.1٪ حمض الأسكوربيك 200 ميكرومتر 0.5 ميكرومتر < ص الفئة = "jove_content" >الجدول 3: المكملات المتوسطة للخلايا العصبية الحركية.تضاف المكملات الغذائية طازجة في يوم الاستخدام إلى الوسط القاعدي للخلايا العصبية الحركية.

يوم الكاشف تركيز المخزون التركيز النهائي غرفة اليوم 10/11 ناهض ناعم 10 ملم 500 نانومتر كلا حمض الريتينويك 1 ملي متر 0.1 ميكرومتر DAPT 100 ملم 10 ميكرومتر BDNF 0.1 مجم / مل 10 نانوغرام / مل GDNF 0.1 مجم / مل 10 نانوغرام / مل يوم 14 DAPT 100 ملم 20 ميكرومتر كلا BDNF 0.1 مجم / مل 10 نانوغرام / مل GDNF 0.1 مجم / مل 10 نانوغرام / مل اليوم 16 DAPT 100 ملم 20 ميكرومتر كلا BDNF 0.1 مجم / مل 10 نانوغرام / مل GDNF 0.1 مجم / مل 10 نانوغرام / مل CNTF 0.1 مجم / مل 10 نانوغرام / مل يوم 18 BDNF 0.1 مجم / مل 10 نانوغرام / مل الخلايا العصبية الحركية GDNF 0.1 مجم / مل 10 نانوغرام / مل CNTF 0.1 مجم / مل 10 نانوغرام / مل يوم 21+ BDNF 0.1 مجم / مل 30 نانوغرام / مل الأنبوب العضلي GDNF 0.1 مجم / مل 30 نانوغرام / مل CNTF 0.1 مجم / مل 30 نانوغرام / مل أجرين 50 ميكروغرام / مل 0,01 ميكروغرام / مل لامينين 1 ملغ/مل 20 ميكروغرام / مل اليوم 21+ لا توجد مكملات غذائية الخلايا العصبية الحركية

الجدول 4: وسيط التمايز MAB.يمكن أن يستمر المتوسط لمدة أسبوعين عند 4 درجات مئوية. يضاف Agrin طازجا في يوم الاستخدام.

يوم الكاشف تركيز المخزون التركيز النهائي غرفة اليوم 18 DMEM / F12 97٪ MAB بيروفات الصوديوم 100 ملم 1٪ مصل الحصان 2٪ أجرين 50 ميكروغرام / مل 0.01 ميكروغرام / مل

النتائج

الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على بروتوكول الوحدة الحركية في أجهزة الموائع الدقيقة.الجدول الزمني للتمايز ونظرة عامة على الثقافة المشتركة من اليوم 0 إلى اليوم 28 وفقا للجدول الزمني لبروتوكول تمايز الخلايا العصبية الحركية. يبدأ تمايز الخلايا العصبية الحركية من iPSCs في اليوم 0 ويتم إجراؤه كما هو مذكور سابقا لمدة 10 أيام تالية. في اليوم 9 ، يتم تعقيم الجهاز وتغطيته ب PLO-laminin. يتم إذابة MABs للتوسع في ق...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حمض الخليك كيم لاب نيفادا CL00.0116.1000 مكون الطلاء. H226 ، H314. ص 280 Agrin (بروتين بشري مؤتلف) أنظمة البحث والتطوير 6624-AG-050 ملحق وسائط الإعلام حمض الأسكوربيك سيغما أ 4403 مكون الوسائط βIII-توبولين (توبولين) أبكام أب7751 الأجسام المضادة (1:500) β ميركابتو إيثانول ثيرمو فيشر العلمي 31350010 مكون الوسائط. H317. ص 280. ب 27 بدون فيتامين أ ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 12587-010 مكون الوسائط BDNF (عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ) بيبروتك 450-02 ب عامل النمو bFGF (عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية المؤتلفة البشرية) بيبروتك 100-18 ب عامل النمو الكولاجين من جلد العجل ثيرمو فيشر العلمي 17104019 مكون الطلاء CNTF (عامل التغذية العصبية الهدبي) بيبروتك 450-13 ب عامل النمو DAPT توكريس بيوساينس 2634 ملحق وسائط الإعلام DMEM / F12 ثيرمو فيشر العلمي 11330032 مكون الوسائط DMSO سيغما D2650-100 مل مكون الحفظ بالتبريد. H315 ، H319 ، H335. ص 280. محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) ثيرمو فيشر العلمي 14190250 خال من الكالسيوم ولا المغنيسيوم ايثانول VWR 20.821.296 تعقيم. H225. ص 280 مصل الأبقار الجنينية ثيرمو فيشر العلمي 10270106 مكون الوسائط وسط تركيب التألق داكو S3023 مكون الكيمياء المناعية GDNF (عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية) بيبروتك 450-10 ب عامل النمو مصل الحصان ثيرمو فيشر العلمي 16050122 مكون الوسائط IMDM ثيرمو فيشر العلمي 12440053 مكون الوسائط ترانسفيرين الأنسولين السيلينيوم ثيرمو فيشر العلمي 41400045 مكون الوسائط استبدال مصل الضربة القاضية ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 10828-028 مكون الحفظ بالتبريد Laminin من Engelbreth-Holm-Swarm غشاء القاعدي لساركوما الفئران سيغما L2020-1MG مكون الطلاء وملحق الوسائط ل-جلوتامين ثيرمو فيشر العلمي 25030-024 مكون الوسائط مكمل N-2 ثيرمو فيشر العلمي 17502-048 مكون الوسائط الوسط العصبي القاعدي ثيرمو فيشر العلمي 21103049 مكون الطلاء والوسائط الأحماض الأمينية غير الأساسية ثيرمو فيشر العلمي 11140050 مكون الوسائط بارافيلم م سيغما P7793-1EA معدات التخزين البنسلين / الستربتومايسين (5000 وحدة / مل) ثيرمو فيشر العلمي 15070063 مكون الوسائط صحن بتري (3 سم) نونك 153066 قطر الدائرة: 3 سم صحن بتري (10 سم) سارستيدت 833.902 دولار القطر: 10 سم طبق (6 آبار) سيلستار غرينر بيو ون 657160 لوحة الثقافة بولي إل أورنيثين (PLO) سيغما P3655-100 ملغ مكون الطلاء حمض الريتينويك سيغما R2625 ملحق الوسائط. H302 ، H315 ، H360FD ، H410. ص 280. مكمل خلية ريفيتا ثيرمو فيشر العلمي A2644501 محلول مثبط الصخور ناهض ناعم ميرش ميليبور 566660 ملحق وسائط الإعلام بيروفات الصوديوم تقنيات الحياة هاتف: 11360-070 مكون الوسائط قارورة T75 سيغما CLS3276 لوحة الثقافة تريب إل إكسبريس ثيرمو فيشر العلمي 12605010 حل تفكك MAB توبوسيرارین هيدروكلوريد خماسي هيدرات سيغما تي 2379-100 جرام حاصرات مستقبلات أستيل كولين. H301. ص 280. جهاز الموائع الدقيقة المجمعة مسبقا من XonaChips Xona Microfluidics فولكس XC150 طول Microgroove: 150 ميكرومتر