$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
< p class = "jove_title" >
1. تشريح الأجنة وتفكك الأنسجة
- إيواء إناث الفئران البالغة (200-250 جم) عند درجة حرارة ثابتة (22 ± 1 درجة مئوية) ورطوبة نسبية (50٪) في ظل جدول منتظم للضوء والظلام (إضاءة من 7 صباحا إلى 7 مساء) في منشأة. ضمان توفر الطعام والماء مجانا.
- تخدير أنثى الفئران الحامل بعد 18 يوما من النمو (E18) باستخدام 3٪ إيزوفلوران. ثم قم بالتضحية بالحيوان عن طريق خلع عنق الرحم.
- قم بإزالة الحصين من كل جنين فأر وضعه في محلول الملح المتوازن من هانك المثلج بدون Ca2+ و Mg2+. في اليوم 18 من التطور ، تكون أنسجة الحصين والقشرة ناعمة جدا ولا تحتاج إلى تقطيعها إلى قطع صغيرة. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل.
- قم بفصل الأنسجة في 0.125٪ من محلول التربسين / هانك الذي يحتوي على 0.05٪ من الحمض النووي لمدة 18-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- قم بإزالة المحلول الطافي باستخدام ماصة باستور وأوقف الهضم الأنزيمي عن طريق إضافة وسيط يحتوي على 10٪ مصل بقري للجنين (FBS) لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة الوسط باستخدام FBS واغسله مرة واحدة بالوسط باستخدام مكمل L-glutamine 1٪ ، جنتاميسين 10 ميكروغرام / مل. قم بإزالة الوسط مرة أخرى باستخدام ماصة باستور وأعد تعبئته مرة أخرى بكمية صغيرة (500 ميكرولتر) من وسط النمو مع مكملته ، 1٪ L-glutamine ، gentamicin 10 ميكروغرام / مل.
- قم بفصل حبيبات الأنسجة ميكانيكيا باستخدام ماصة باستور ضيقة حتى يظهر معلق حليبي للخلايا. ليس من الضروري الطرد المركزي لتعليق الخلية.
قم - بتخفيف الحجم الصغير من تعليق الخلية بوسط النمو للحصول على حجم نهائي يبلغ 2.0 مل. احسب التركيز الخلوي الذي تم الحصول عليه باستخدام غرفة مقياس الدم. قم بتخفيف هذا التركيز عند 1: 5 من أجل الحصول على تركيز الخلية المطلوب من 600-700 خلية / ميكرولتر.
< p class = "jove_title" >
2. طلاء الخلية
- خلايا صفيحة بكثافة حوالي 2,000 خلية / مم2 على المنطقة النشطة من الشرق الأوسط وإفريقيا ، والتي يحددها قيد PDMS لإنشاء شبكة عصبية ثنائية الأبعاد.
ملاحظه: يحتوي كل حصين على حوالي 5 × 105 خلايا (1 × 106 لجنين واحد). قم بتشريح 6 أجنة للحصول على كمية إجمالية تبلغ 6 × 106 خلايا في 2 مل ، وتركيز يقدر ب 3,000 خلية / ميكرولتر. قم بتخفيف هذا التركيز عند 1: 5 من أجل الحصول على تركيز الخلية المطلوب ولوحة حوالي 600-700 خلية / ميكرولتر. إذا كانت منطقة MEA المحددة بقيد PDMS حوالي 7.065 مم2 ، والعدد الإجمالي للخلايا المطلية 600 خلية / ميكرولتر × 24 ميكرولتر = 14,400 خلية ، فإن الكثافة النهائية 2,038 خلية / مم2.
- ضع أجهزة MEA في الحاضنة ذات الغلاف الجوي المرطبCO2 (5٪) عند 37 درجة مئوية.
- قم بتوزيع 160 ميكرولتر من المعلق بتركيز خلية يتراوح بين 600 و 700 خلية / ميكرولتر (حوالي 100,000 خلية) على سطح الطبقة الأحادية للحبات الدقيقة الموضوعة داخل الألواح متعددة الآبار لإكمال الخطوة الأولية لبناء ثقافة ثلاثية الأبعاد. ضع الألواح متعددة الآبار في الحاضنة ذات الغلاف الجوي المرطبCO2 (5٪) عند 37 درجة مئوية.
3. 3D بناء الشبكة العصبية
- بعد 6-8 ساعات من الطلاء ، انقل التعليق (الميكروبيدات مع الخلايا العصبية) من الألواح متعددة الآبار بعناية فائقة داخل المنطقة المحددة بقيود PDMS باستخدام مجموعة ماصة لحجم حوالي 30-40 ميكرولتر. بعد كل عملية نقل ، انتظر لمدة نصف دقيقة تقريبا ، للسماح للميكروبيدات بالتجميع الذاتي في هيكل مضغوط سداسي.
- بمجرد ترسيب جميع الطبقات وتجميعها تلقائيا ، أعد التعبئة بقطرة كبيرة تبلغ حوالي 300 ميكرولتر من الوسط الجزء العلوي من المنطقة المحددة بقيود PDMS.
- ضع الهيكل ثلاثي الأبعاد مقترنا بمنطقة الشرق الأوسط وأفريقيا في حاضنة (T = 37.0 درجة مئوية ، ثاني أكسيدالكربون 2 = 5٪) لمدة 48 ساعة قبل إضافة حجم نهائي (حوالي 1 مل) من ثقافة وسط النمو مع مكملها.
ملاحظه: ضع في اعتبارك العدد الإجمالي للحبات على الألواح متعددة الآبار مع إدراج الغشاء (30,000) وعدد الخرزات على طبقة واحدة على جهاز MEA (6,000). يتكون الهيكل ثلاثي الأبعاد الناتج من 5 طبقات من الميكروبيدات والخلايا. بالنظر إلى أن الشبكة العصبية ثلاثية الأبعاد ليست مثالية هندسيا ، يمكن أن يتكون الهيكل ثلاثي الأبعاد الناتج من 5-8 طبقات.
- في اليوم التالي للطلاء ، أضف بعناية الحجم النهائي للوسط (حوالي 900 ميكرولتر) داخل حلقة MEA. الحفاظ على الثقافات ثلاثية الأبعاد في جو مرطب من ثاني أكسيد الكربون2 (5٪) عند 37 درجة مئوية لمدة 4-5 أسابيع. استبدل نصف الوسيط مرة واحدة في الأسبوع.