تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير وزراعة الخلايا النجمية القشرية
ملاحظة: أكمل خطوات البروتوكول هذه على الأقل 7 أيام قبل الانتقال إلى الخطوات التالية ، حيث يجب أن تتطور ثقافات الخلايا النجمية إلى طبقات أحادية متجمعة قبل تحضير الخلايا العصبية. يتم اشتقاق الخلايا النجمية الأولية من الثقافات الدبقية المختلطة التي تم الحصول عليها من صغار الفئران في يوم ما بعد الولادة (P) 0-3. يجب استخدام ثلاثة أدمغة (6 قشر) لكل قارورة T75.
- تحضير وسط الخلايا النجمية عن طريق استكمال Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) بمصل الحصان بنسبة 10٪ v / v و 0.1٪ v / v gentamicin في ظل ظروف معقمة. قم بتخزين الوسط عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
- قم بتغطية قوارير 3x T75 ب 10 ميكروغرام / مل بولي دي ليسين (PDL ؛ في ماء من درجة زراعة الخلايا) لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 37 درجة مئوية في وجود 6٪ مقابل / حجم ثاني أكسيدالكربون 2. بعد الطلاء ، اغسل القوارير مرتين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة الكاتيونات غير المرتبطة ، وأضف 9 مل من وسط الخلايا النجمية.
- لتحضير الأدمغة ، أضف 10 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) إلى طبق بتري 1 × 10 سم و 1 مل HBSS إلى 1 × 15 مل أنبوب (بغض النظر عن عدد الأدمغة التي سيتم استخدامها). احتفظ بزوج من المقص الجراحي ، و 2 ملقط ناعم ، ومنظار في متناول اليد للإجراء.
- اقطع رأس 3 صغار بسرعة بالمقص الجراحي واجمع الرؤوس في طبق فارغ مقاس 10 سم.
- قم بإعداد القشرة تحت المنظار. باستخدام ملقطين دقيقين ، قم بإزالة الجلد الظهري من الجمجمة عند خط الوسط ، بدءا من الرقبة إلى مستوى العينين. بعد ذلك ، يظهر الدماغ بأعيته الدموية تحت الجمجمة.
- ثبت الرأس في الطرف المنقاري بزوج من الملقط وشق خط الوسط للجمجمة ، بدءا من النهاية الخلفية. بعد ذلك ، قم بقص النصفين الأيمن والأيسر من الجمجمة لفضح الدماغ.
- أغلق طرف الملقط وضعه بطنيا أسفل الدماغ. ارفع الدماغ من الجمجمة وانقله إلى طبق بتري المليء ب HBSS مقاس 10 سم. استمر بنفس الطريقة مع العينة المتبقية حتى يتم جمع جميع الأدمغة في الطبق.
- بعد جمع الأدمغة ، ابدأ بفصل القشرة عن طريق الضغط على الدماغ الخلفي باستخدام زوج من الملقط مثل زوج من المقص. قم بإجراء شق خط الوسط بين نصفي الكرة الأرضية بزوج واحد من الملقط. قم بإصلاح الدماغ بعناية باستخدام ملقط وقطع الدماغ المتوسط والبصيلات الشمية باستخدام ملقط ثان لينتهي به الأمر بالنصفين القشريين.
- قم بإصلاح نصف قشري واحد بزوج واحد من الملقط وقشر السحايا من نصفي الكرة الأرضية عن طريق فصلها عن الحافة الجانبية ثم سحبها لاحقا من السطح القشري باستخدام ملقط ثان.
- اقلب النصف القشري بحيث يكون سطحه متجها لأسفل نحو الطبق ؛ قم بتشريح وإزالة الحصين على شكل هلال بعناية باستخدام زوج واحد من الملقط. انقل القشرة المفردة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ملقط مغلق واحد لحمل قشرة فردية.
- بعد جمع جميع القشرة ، انتقل إلى غطاء التدفق الصفحي المعقم وابدأ بالاستعدادات لتفكك الأنسجة القشرية.
- أضف 1 مل DMEM إلى أنبوب تفاعل سعة 2 مل وأضف 0.1٪ وزن / حجم غراء (30 وحدة). احتضان المعلق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى يتطور محلول واضح (حوالي 3 دقائق). أضف 0.24 مجم / مل L-cysteine و 20 ميكروغرام / مل DNA ورجه برفق.
ملاحظة: للهضم ، هناك حاجة إلى حوالي 1 مل من محلول الإنزيم.
- قم بالتصفية (حجم المسام 0.22 ميكرومتر) للحصول على محلول معقم سعة 1 مل قبل إضافته إلى الأنسجة القشرية. احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة - 1 ساعة عند 37 درجة مئوية (أي في حمام مائي).< / >
ملاحظة: الخطوات من 1.11 إلى 1.14 حاسمة ويجب إكمالها في غضون 15 دقيقة.
- لإنهاء تفاعل الهضم ، أضف 1 مل من وسط الخلايا النجمية وقم بتقطيع الأنسجة المهضومة بعناية باستخدام ماصة سعة 1 مل. للخلية ، حرك مكبس الماصة برفق ، وبالتالي شفط وبثق تعليق الأنسجة القشرية.
- بمجرد تفكيك الأنسجة في معلق أحادي الخلية ، أضف 5 مل من وسط الخلايا النجمية وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 216 × جم.
- استنشق المادة الطافية بعناية من الحبيبات الناتجة وأعد تعليق الخلايا في وسط الخلايا النجمية سعة 1 مل.
- أضف معلقات الخلية إلى قوارير T75 التي تم تجديدها بوسط الخلايا النجمية سعة 9 مل (انظر 1.2).
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في الحاضنة في وجود 6٪ مقابل / حجمثاني أكسيد الكربون 2. بعد 4 د ، قم بإجراء أول تغيير متوسط كامل (10 مل). بعد ذلك ، قم بتغيير وسط الثقافة كل 2-3 أيام.
- بعد 7 أيام ، تحقق مما إذا كانت الخلايا قد شكلت طبقة أحادية التقاء. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فانتظر لمدة 2-3 أيام أخرى حتى يتم تحقيق التقاء كامل للثقافة.
ملاحظة: تعرض الخلايا النجمية أجساما خلوية كبيرة ومسطحة ، وتوطين في الجزء السفلي من القارورة ، ولا تطور عمليات خلوية ملحوظة. وهي تختلف عن الخلايا السلفية الساطعة الصغيرة على تباين الطور والخلايا الدبقية الصغيرة الموجودة فوق الطبقة الأحادية.
- من أجل التخلص من الخلايا السلفية والحصول على ثقافة الخلايا النجمية النقية ، ضع قوارير T75 على شاكر مداري وهز الثقافات O / N عند 250 دورة في الدقيقة. تأكد من ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وأن مرشح القارورة مغلق بغشاء مختبر لمنع تبخر ثاني أكسيد الكربون2.
- في اليوم التالي ، استنشق الوسط وأضف 10 مل من وسط الثقافة الطازجة المتجدد ب 20 ميكرومتر من السيتوزين -1-β-D-arabinofuranoside (AraC) للقضاء على الخلايا المنقسمة المتبقية.
ملاحظة: الحضانة مع AraC لمدة 2-3 د في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 6٪ ثاني أكسيد الكربون2 ستؤدي إلى ثقافة الخلايا النجمية النقية.
- مراقبة نقاء مزارع الخلايا النجمية عن طريق الفحص البصري تحت المجهر الضوئي. إذا كانت الخلايا السلفية الساطعة المتبقية على تباين الطور والخلايا الدبقية الصغيرة لا تزال موجودة فوق الطبقة الأحادية النجمية (انظر الخطوة 1.16) ، كرر الخطوتين 1.18 و 1.19.
ملاحظة: يمكن الحفاظ على الطبقات أحادية الخلايا النجمية المتقاربة والنقية لمدة تصل إلى 14 يوما في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 6٪ من ثاني أكسيد الكربون2) قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. قم بتغيير نصف الوسيط كل 3 أيام. لا تجمع الخلايا النجمية وتجمدها وتذويبها ، لأن هذه الخلايا ستفقد خصائصها الداعمة للخلايا العصبية من خلال إجراء التخزين.
< p class = "jove_title" >
2. تحضير الخلايا النجمية للزراعة المشتركة غير المباشرة
< ص الفئة = "jove_content" >
ملاحظة: 48 - 72 ساعة قبل تحضير الخلايا العصبية ، انقل الخلايا النجمية إلى إدخالات ثقافة الخلية. بشكل عام ، توفر قارورة T75 واحدة عددا كافيا من الخلايا لدعم الثقافات العصبية التي تم الحصول عليها بمستحضر واحد.
- ضع أكبر عدد ممكن من الإدخالات حسب الحاجة في 24 لوحا من 24 بئرا. قم بتغطية كل ملحق ب 10 ميكروغرام / مل PDL (مذاب في ماء من درجة زراعة الخلايا) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، 6٪ مقابل / حجم ثاني أكسيدالكربون 2. بعد الحضانة ، اغسل الإدخالات مرتين باستخدام PBS. في غضون ذلك ، تابع تحضير الخلايا النجمية.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالإدخالات المملوءة ب PBS حتى يصبح تعليق الخلايا النجمية جاهزا للاستخدام.
- شفط وسط الخلايا النجمية (باستخدام AraC) واغسل المزرعة مرة واحدة باستخدام 10 مل PBS لضمان إزالة أي مصل متبقي.
- أضف 3 مل من 0.05٪ تريبسين-EDTA (حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك) إلى القوارير واحتضان الخلايا للتربسين عند 37 درجة مئوية ، 6٪ حجم / حجمثاني أكسيد الكربون 2 لمدة 10 دقائق تقريبا.
- تحكم في انفصال الخلية عن طريق الفحص البصري باستخدام المجهر وقم بتسهيل انفصال الخلايا عن طريق النقر على جانب القوارير على سطح المكتب.
ملاحظة: الخطوات من 2.5 إلى 2.8 مهمة ويجب الانتهاء منها في غضون 15 - 20 دقيقة.
- بعد التربسين ، أعد تعليق الخلايا برفق في وسط الخلايا النجمية سعة 7 مل وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 216 × جم.
- استنشق المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط الخلايا النجومية.
- عد الخلايا باستخدام غرفة العد.
- املأ قاع آبار الصفيحة المكونة من 24 بئرا بوسط الخلايا النجمية سعة 500 ميكرولتر وانقل 25,000 خلية في وسط الخلايا النجمية سعة 500 ميكرولتر إلى كل إدراج فردي. احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية ، 6٪ مقابل / حجم ثانيأكسيد الكربون 2.
ملاحظة: بعد 42 - 72 ساعة ، ستصل الثقافات إلى ما يقرب من 100٪ من التقاء. في هذه المرحلة ، يمكن التحقق من نقاء الثقافة عن طريق الكيمياء المناعية. يمكن الحفاظ على الثقافات المتقاربة لمدة تصل إلى 7 أيام حتى الانتقال إلى الخطوة التالية. قم بتغيير نصف الوسيط كل 3 أيام.
< p class = "jove_title" >
3. تحضير الخلايا العصبية الأولية للحصين
ملاحظة: يجب اشتقاق الخلايا العصبية الأولية للحصين في الفئران من أجنة E15.5 - E16 للفئران الحامل الموقوتة.
- تحضير وسط الخلايا العصبية (MEM مع 10 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 0.1٪ وزن / حجم أوبلومومين ، و 2٪ v / v B27 المكمل الغذائي المتوسط ، و 0.1٪ v / v gentamicin (مفلتر معقم)) ، ووسط التحضير (HBSS مع 0.6٪ وزن / حجم جلوكوز و 10 ملي مولار HEPES (4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازين حمض إيثان سلفونيك)). قم بتسخين وسط الخلايا العصبية مسبقا وموازنه مسبقا في قوارير المرشح عند 37 درجة مئوية ، 6٪ مقابل / حجم ثاني أكسيد الكربون2.
- ضع الغطاء الزجاجي (قطره 12 مم) في آبار 24 لوحا جيدا (استخدم الطبقات الخاصة ، والتي يتم إحرازها للاستخدام مع إدخالات زراعة الخلايا).
- قم بتغطية لمدة ساعة واحدة على الأقل ب 15 ميكروغرام / مل Poly-DL-Ornithine في الماء (درجة زراعة الخلية) عند 37 درجة مئوية. استخدم 500 ميكرولتر على الأقل لكل بئر للتأكد من تغطية الغطاء بالكامل. اغسل الآبار مرتين باستخدام PBS. اترك PBS في الآبار حتى طلاء الخلايا. تأكد من أن الآبار لا تجف.
- لتشريح الحصين ، قم بإعداد أطباق 3 × 10 سم مليئة بوسط تحضير وأنبوب 1 × 2 مل مع وسط تحضير 1 مل. تحضير مقص و 2 ملقط ناعم.
- التضحية بالفأر الحامل عن طريق خلع عنق الرحم ، وتعقيم البطن عن طريق الغسيل بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وافتح البطن باستخدام مقص حاد. استئصال الرحم المطرز بعناية بالمقص وانقل العضو إلى طبق 1 × 10 سم مملوء بوسط التحضير.
- بعد ذلك ، قم بإزالة الأجنة من الرحم. شق الرحم بعناية وإزالة السائل السلوي دون الإضرار بالجنة باستخدام ملقطين. بعد ذلك ، قم بقطع رأس كل جنين بمقص وانقل الرؤوس إلى طبق ثان مقاس 10 سم مزود بوسط تحضير.
- استمر في تحضير الرؤوس (على غرار المستحضر الموصوف في 1.4 - 1.7).
- شل حركة الرأس بزوج من الملقط وشق الجمجمة والجلد في منطقة الرقبة بالقرب من الدماغ الخلفي ، عموديا على المحور العصبي. استخدم زوجا ثانيا من الملقط لرفع كل من الجمجمة وتغطية الجلد ، وثني غطاء الجمجمة الناعم باتجاه الطرف المنقاري للرأس ، وبالتالي تعريض الدماغ.
- بمساعدة ملقط 2 ، افصل الدماغ عن تجويف الجمجمة. للقيام بذلك ، أغلق زوجا واحدا من الملقط وافصل الدماغ عن الجمجمة بدءا من البصيلات الشمية والانتقال نحو الدماغ الخلفي. اجمع الأدمغة في طبق آخر مقاس 10 سم مليء بوسط التحضير.
- قم بتشريح الحصين من شقوق القشرة كما هو موضح أعلاه لإعداد الخلايا النجمية (الخطوة 1.6). قم بإزالة الحصين من كل نصف كرة كرة وجمعه في أنبوب سعة 2 مل مملوء بوسط التحضير.
- بعد الانتهاء من التشريح ، انقل الأنبوب إلى مقعد التدفق الصفحي المعقم وهضم أنسجة الحصين بمحلول هضم 1 مل يحتوي على غراء. قم بإعداد محلول الهضم كما هو موضح في الخطوة 1.9 - 1.10 ، ولكن استخدم MEM بدلا من DMEM.
ملاحظة: الخطوات 3.9 - 3.12 مهمة ويجب إكمالها في غضون 10 - 15 دقيقة.
- بعد الانتهاء من الهضم ، اسحب محلول الهضم بعناية عن طريق الشفط اللطيف باستخدام ماصة.
- اغسل الحصين 3 مرات بوسط الخلايا العصبية عن طريق إضافة 1 مل من وسط الثقافة الطازجة بالتتابع وبعد ذلك شفطه بعناية لكل دورة غسيل. لا تقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية.
- بعد خطوة الغسيل النهائية ، قم بتقطيع الأنسجة بعناية في وسط خلية عصبية سعة 1 مل.
- عد الخلايا باستخدام غرفة العد ولوحة 35,000 خلية في وسط خلية عصبية سعة 500 ميكرولتر لكل بئر واحد من صفيحة 24 بئرا (اللوحة المذكورة في 3.2).
ملاحظة: اختياريا ، يمكن تلطيخ الخلية باللون الأزرق لتقييم حيوية تحضير الخلية. تحكم في كثافة الطلاء عن طريق الفحص البصري باستخدام المجهر (عادة 90-110 خلية لكل مجال بصري لهدف قياسي 10X).
- ضع الخلايا العصبية في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 6٪ مقابل / حجمثاني أكسيد الكربون 2 لمدة 1 ساعة.
- بعد الحضانة ، أخرج الإدخالات المحضرة (المصنفة بطبقات أحادية الخلايا النجمية المتقاربة) من الحاضنة (انظر الخطوة 2.8). استبدل الوسط عن طريق شفط وسط الخلايا النجمية واستبداله ب 500 ميكرولتر من وسط الخلايا العصبية الطازجة.
ملاحظة: يجب أن تحتوي الإدخالات على طبقات أحادية من الخلايا النجمية المتقاربة بعد 2-3 DIV (أيام في المختبر).
- ضع الحشوات التي تحتوي على الخلايا النجمية بعناية في الآبار التي تحتوي على مزارع الخلايا العصبية (الخطوة 3.13) باستخدام ملقط معقم.
- ضع الزراعة المشتركة للخلايا العصبية والخلايا النجمية غير المباشرة الناتجة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 6٪ مقابل / حجمثاني أكسيد الكربون 2.
ملاحظة: في ظل هذه الظروف ، يمكن زراعة الخلايا العصبية لمدة تصل إلى 4 أسابيع في وسط محدد تماما. لا يوجد تغيير متوسط ضروري. بالنسبة للثقافات طويلة الأمد ، يوصى بملء الآبار الفارغة بالماء المعقم لتقليل التبخر من الصفيحة المكونة من 24 بئرا.
