تقنية بسيطة لعزل وزراعة الخلايا النجمية الفئرانية

الملخص

المصدر: Wolfes ، A. C. ، et al. ، زراعة الخلايا النجمية الفئران الشبيهة بالجسم الحي باستخدام بروتوكول AWESAM السريع والبسيط وغير المكلف. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح الفيديو طريقة بسيطة لزراعة الخلايا النجمية للفئران بمعزل عن خلايا الدماغ الأخرى. أثناء الاستزراع ، باستخدام وسائط خاصة بالخلايا النجمية وتثبيط التصاق الخلايا غير النجمية ، تقوم الطريقة بزراعة الخلايا النجمية بشكل انتقائي. تظهر هذه الخلايا النجمية المستزرعة مورفولوجيا نجمية مع عمليات دقيقة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. تشريح دماغ الفئران أو الفأر

ملاحظة: يمكن استخدام كل من الفئران والجرذان. يمكن أيضا استخدام الأقدم من P8 (اختبرنا حتى P12) ، لكن إزالة السحايا ستصبح صعبة بشكل متزايد. علاوة على ذلك ، سوف يتضاءل محصول الخلية وصحتها ، لأن خلايا الدماغ من الأكبر سنا ستكون قد شكلت عمليات ووصلات معقدة قد تنكسر أثناء تفكك الأنسجة ، مما يؤدي إلى زيادة موت الخلايا. يتم وصف المستحضرات القشرية هنا ، ولكن يمكن أيضا استخدام مناطق الدماغ الأخرى.

1. ضع 0.05٪ تريبسين EDTA في حمام مائي 37 درجة مئوية.
2. قتل (الفئران الحامل لصغار E19 ، أو P0-P8) عن طريق رفع تركيز ثاني أكسيد الكربون_ببطء ، وعزل الأدمغة. تتطلب الخطوات التالية تقنية معقمة.
3. إذا كنت تعمل مع الأنسجة الجنينية ، فقم أولا بإزالة الأجنة من الرحم وافتح الأكياس الجنينية ، ثم اقطع الرؤوس على الفور بالمقص. عندما يتم قطع جميع الرؤوس ، انقلها إلى وسط تشريح مبرد مسبقا.
   1. بمجرد غمر الرؤوس في الوسط ، افتح الجلد والجمجمة (كلاهما ناعم جدا في الصغيرة) بالملقط واضغط على المخيخ. ارفع بعناية بقية الدماغ لأعلى وخارج الجمجمة.
      ملاحظه: ينتج عن اثنين إلى أربعة أجنة E19 أنسجة كافية لثمانية أطباق على الأقل 10 سم من الخلايا النجمية القشرية المطلية ب 500,000 خلية لكل طبق في يوم التشريح.
4. بالنسبة لحديثي الولادة أو الأكبر سنا ، قم بقطع الرؤوس بالمقص ، وعزل الأدمغة عن طريق قطع الجلد وسطيا في خط مستقيم من مؤخرة الرأس إلى طرف الأنف. اسحب الجلد جانبا واقطع الجمجمة بعناية إلى اليسار واليمين ، ثم ارفع عظم الجمجمة لأعلى. اقطع المخيخ ، وارفع بقية الدماغ لأعلى وخارج الجمجمة.
   ملاحظه: ينتج اثنان إلى ثلاثة صغار P0-P8 أنسجة كافية لثمانية أطباق على الأقل 10 سم من الخلايا النجمية القشرية المطلية ب 500,000 خلية لكل طبق في يوم التشريح.
5. افصل القشرة عن بنية الدماغ المتوسط الأساسية. ضع الملقط داخل الشق الطولي بين نصفي الكرة الأرضية ، ثم حرك الملقط بين القشرة وهياكل الدماغ المتوسط لنصف الكرة الأرضية (عموديا على الشق الطولي) لقرص كل نصف كرة مجاني.
6. باستخدام الملقط ، قم بإزالة جميع السحايا من كل نصف كرة أرضية (والحصين) ، ثم افصل الحصين. إذا كانت الخلايا النجمية في الحصين مطلوبة ، فقم بنقل كل حصين إلى أنبوب سعة 15 مل مملوء بوسط تشريح 14 مل على الجليد.
7. قم بإزالة مناطق أخرى من قشرة كل نصف كرة إذا كانت هناك حاجة إلى مناطق محددة (على سبيل المثال ، القشرة الأمامية). قطع أي نسيج قشري لاستخدامه لتوليد الخلايا النجمية إلى قطع لا يزيد حجمها عن 1 مم 3. اجمع كل قطع الأنسجة القشرية في أنبوب منفصل سعة 15 مل مملوء بوسط تشريح على الجليد.

< ص الفئة = "jove_title" >2. هضم الأنسجة وتفككها

1. بمجرد جمع جميع قطع الأنسجة ، انتظر حتى تستقر في قاع الأنبوب ، ثم استنشق أكبر قدر ممكن من الوسط.
2. أضف 2-3 مل من 0.05٪ تريبسين-EDTA باستخدام ماصة مصلية ، واحتضن الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة < br / > ملاحظه: حرر كل التربسين-EDTA من الماصة بسرعة لخلط قطع المناديل والسماح لها بالاستقرار مرة أخرى.
3. قم بشفط التربسين EDTA بعناية ، مع ترك قطع المناديل في أقل قدر ممكن من السائل ، في الجزء السفلي من الأنبوب.
4. أضف 5 مل من وسط التشريح المبرد مسبقا لغسل ما تبقى من التربسين-EDTA. الماصة إلى جانب الجزء العلوي من الأنبوب لتحقيق خلط قطع الأنسجة.
5. استنشق وسط التشريح ، واترك قطع المناديل في أقل قدر ممكن من السائل. كرر خطوة الغسيل هذه مع وسيط التشريح المبرد مسبقا مرتين أخريين.
6. بعد خطوة الغسيل النهائية، أضف 1 مل من DMEM+ (دافئ إلى درجة حرارة الغرفة) باستخدام طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر، وقم بترقيم الأنسجة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل دون إدخال فقاعات.
   ملاحظه: من المهم تجنب إنتاج الفقاعات ، لأن هذا قد يغير درجة الحموضة في المحلول ، والتي تكون الخلايا النجمية حساسة جدا تجاهها.
7. ضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر في فتحة أنبوب سعة 50 مل وبلل الفلتر مسبقا ب 4.5 مل من DMEM + المبرد مسبقا.
8. ماصة 1 مل من تعليق الأنسجة المنفصلة على مصفاة الخلية وإضافة 4.5 مل أخرى DMEM + المبرد مسبقا لغسل الخلايا من خلال مصفاة الخلية.

3. خلايا المرور

1. في اليوم السابق للمرور ، قم بتغطية ألواح زراعة الخلايا بنسبة 0.04٪ PEI.
2. في اليوم المختبري (DIV) 7 بعد التشريح ، ضع الأطباق مقاس 10 سم التي تحتوي على خلايا في DMEM + على شاكر المختبر في الحاضنة ورج الأطباق بسرعة 110 دورة في الدقيقة لمدة 6 ساعات.
3. اغسل PEI من الطبقات المطلية بالماء المقطر منزوع الأيونات مرتين. أضف وسط NB + H إلى الألواح (500 ميكرولتر لكل بئر لألواح 24 بئرا و 2 مل لكل بئر لألواح 6 آبار). قم بموازنة الألواح في الحاضنة مسبقا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ أثناء اهتزاز الأطباق مقاس 10 سم ، أو لمدة 30 دقيقة على الأقل.
4. قبل 20-30 دقيقة من نهاية الاهتزاز لمدة 6 ساعات ، وتسخين 1x PBS و DMEM + و NB + H و 0.25٪ trypsin-EDTA إلى 37 درجة مئوية في الحمام المائي.
5. بعد 6 ساعات من الاهتزاز ، انزع أطباق الثقافة عن الخلاط واستبدل الوسط على الفور (الذي يحتوي على الخلايا العصبية المخفوقة ، والخلايا الدبقية قليلة التغصن ، والخلايا الدبقية الصغيرة) ب 10 مل 1x PBS مسخن مسبقا لكل ><طبق. ملاحظه: من المهم شفط الوسط القديم الذي يحتوي على خلايا منفصلة على الفور لتجنب إعادة ارتباط الخلايا غير النجمية.
6. قم بإزالة PBS وأضف 3 مل من التربسين EDTA المسخن مسبقا لكل طبق. احتضان كل طبق لمدة 4 دقائق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂
7. أضف 5 مل DMEM + مسخن مسبقا إلى 3 مل من التربسين-EDTA في كل طبق، وقم بإخراج الخلايا من الطبق باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل، واجمع معلق الخلية في أنبوب سعة 50 مل.
   ملاحظه: الماصة مباشرة من قاع الطبق - يجب أن تصبح أرضية الطبق أكثر وضوحا مع انفصال الخلايا. استخدم فقط الوسط المحتوي على المصل (بدلا من DMEM+) ، حيث يعطل المصل التربسين.
8. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 3,220 × جم عند 20 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
9. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل NB + H مسخن مسبقا.

< p class = "jove_title" >4. طلاء الخلية لثقافات الخلايا النجمية النهائية

1. عد الخلايا.
2. لوحة 20,000 خلية لكل بئر في ألواح 6 آبار (في 2 مل NB + H وسط لكل بئر) أو 5,000 خلية لكل بئر في ألواح 24 بئرا (في 500 ميكرولتر NB + H وسط لكل بئر).
3. احتفظ بمزارع الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ حتى مزيد من العلاج أو التحليل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.05٪ تريبسين EDTA جيبكو 25300054 دافئ في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل الاستخدام 0.25٪ تريبسين EDTA جيبكو هاتف: 25200-056 دافئ في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل الاستخدام مكمل B-27 جيبكو 17504-044 مخزون 50X جلوتاماكس جيبكو 35050-061 مخزون 100X البنسلين / الستربتومايسين جيبكو 15070-063 50 مخزون ؛ البنسلين: 5000 وحدة / مل ؛ ستربتومايسين: 5000 ميكروغرام / مل الوسط العصبي القاعدي جيبكو 21103049 بدون L-glutamine DMEM جيبكو 41966029 HBEGF سيغما 4643 هيبس جيبكو 15630080 HBSS جيبكو 14170112 FCS جيبكو 10437028 برنامج تلفزيوني جيبكو 10010049 1 مرة مصفاة خلية نايلون 100 ميكرومتر دينار بحريني هاتف: 352360 تريبان بلو سيغما تي 8154 حاضنة زراعة الخلايا ثيرمو فيشر العلمي حاضنة زراعة الخلايا Hera Cell 240i شاكر المختبر هايدولف روتاماكس 120 استخدم داخل حاضنة زراعة الخلايا الطرد المركزي إيبندورف 5810 ص