مقالة منهجية

تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان إلى خلايا عصبية على مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Frega ، M. ، et al. ، التمايز العصبي السريع للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لقياس نشاط الشبكة على مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح الفيديو طريقة لتوليد الخلايا العصبية القشرية المثيرة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs). عند تحريض الدوكسيسيكلين ، تفرط hiPSCs في التعبير عن neurogenin-2 ، وهو عامل نسخ خاص بالخلايا العصبية. باستخدام وسائط معينة والزراعة المشتركة مع الخلايا النجمية ، تسهل هذه العملية تمايز hiPSCs إلى خلايا عصبية ذات وصلات متشابكة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

فئة

1. تمايز hiPSCs الإيجابية rtTA / Ngn2 إلى الخلايا العصبية في MEAs ذات 6 آبار وأغطية زجاجية

< p class = "jove_content" >ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم توفير التفاصيل للتمييز بين hiPSCs الإيجابية rtTA / Ngn2 على ركيزتين مختلفتين ، أي MEAs ذات 6 آبار (أجهزة تتكون من 6 آبار مستقلة مع 9 أقطاب كهربائية مرجعية مدمجة لكل بئر) وأغطية زجاجية في آبار صفيحة 24 بئرا. ومع ذلك ، يمكن بسهولة تكييف البروتوكولات مع الركائز الأكبر (على سبيل المثال ، لآبار الألواح المكونة من 12 أو 6 آبار) ، عن طريق توسيع نطاق القيم المذكورة وفقا لمساحة السطح.

  1. قم بإعداد MEAs أو أغطية الزجاج (اليوم 0 واليوم 1)
    1. في اليوم السابق لبدء التمايز ، قم بتعقيم MEAs وفقا لتوصية الشركة المصنعة.
    2. قم بتخفيف بروتين الالتصاق Poly-L-Ornithine (PLO) في ماء معقم فائق النقاء إلى تركيز نهائي 50 ميكروغرام / مل. قم بتغطية مساحة القطب النشط للMEAs ذات 6 آبار عن طريق وضع قطرة 100 ميكرولتر من PLO المخفف في كل بئر. ضع الغطاء في آبار اللوحة المكونة من 24 بئرا باستخدام ملاقط معقمة. أضف 800 ميكرولتر من PLO المخفف في كل بئر. امنع الغطاء من الطفو عن طريق دفعه لأسفل باستخدام طرف الماصة سعة 1000 ميكرولتر.
    3. احتضان المتوسط البيئي المكون من 6 آبار ولوحة O / N ذات 24 بئرا في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2. في اليوم التالي ، استنشق منظمة التحرير الفلسطينية المخففة. اغسل الأسطح الزجاجية للمناطق المتوسطية المكونة من 6 آبار والأغطية مرتين بماء معقم فائق النقاء.
    4. قم بتخفيف اللامينين في DMEM / F12 البارد إلى تركيز نهائي قدره 20 ميكروغرام / مل (للمتوسط المتوسط المكون من 6 آبار) و 10 ميكروغرام / مل (للأغطية الزجاجية). قم على الفور بتغطية منطقة القطب النشط للمتوسطات البيئية المكونة من 6 آبار عن طريق وضع قطرة 100 ميكرولتر في كل بئر. وبالمثل ، أضف 400 ميكرولتر من اللامينين المخفف في كل بئر من الصفيحة المكونة من 24 بئرا لتغطية الغطاء. امنع الغطاء من الطفو عن طريق دفعه لأسفل باستخدام طرف الماصة سعة 1,000 ميكرولتر.
    5. احتضان المتوسط البيئي المكون من 6 آبار ولوحة 24 بئرا في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو من 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ساعتين على الأقل.
  2. لوحة hiPSCs (اليوم 1)
    ملاحظة:     تفترض الأحجام المذكورة في الخطوات 3.2.1 - 3.2.4 أن hiPSCs الإيجابية rtTA / Ngn2 يتم زراعتها في صفيحة مكونة من 6 آبار وأن خلايا بئر واحد يتم حصادها. تعتمد الأحجام المطلوبة لطلاء الخلايا على المتوسطيات البيئية المكونة من 6 آبار و / أو الغطاء على عدد المتوسطيات البيئية ذات 6 آبار و / أو عدد الطبقات التي يتم استخدامها في التجربة ؛ تسمح الأرقام المحددة في الخطوات 3.2.6 - 3.2.8 بالقياس إلى أحجام التجربة المختلفة.
    1. DMEM / F12 دافئ ، CDS و E8 مع 1٪ (v / v) البنسلين / الستربتومايسين إلى R / T. أضف الدوكسيسيكلين إلى التركيز النهائي البالغ 4 ميكروغرام / مل ومثبط ROCK إلى وسط E8.
    2. استنشق الوسط المستهلك لمركبات hiPSCs الإيجابية rtTA / Ngn2 وأضف 1 مل CDS إلى hiPSCs. احتضان 3-5 دقائق في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. تحقق تحت المجهر مما إذا كانت الخلايا تنفصل عن بعضها البعض.
    3. أضف 2 مل DMEM/F12 في البئر، الخلايا برفق باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر وانقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مل. أضف 7 مل DMEM/F12 إلى تعليق الخلية. قم بتدوير الخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. استنشق المادة الطافية وأضف 2 مل من وسط E8 المحضر. افصل hiPSCs عن طريق وضع طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر على جانب الأنبوب سعة 15 مل وإعادة تعليق الخلايا برفق. تحقق تحت المجهر مما إذا كانت الخلايا منفصلة.
    5. تحديد عدد الخلايا (الخلايا / مل) باستخدام غرفة مقياس الدم.
      ملاحظه: عادة ما ينتج عن بئر اللوحة المكونة من 6 آبار عند التقاء 80-90٪ 3.0 - 4.0 ×10 6 خلايا في المجموع.
    6. استنشق اللامينين المخفف. بالنسبة للمناطق المتوسطية والمتوسطة المكونة من 6 آبار ، قم بتخفيف الخلايا للحصول على تعليق خلوي يبلغ 7.5 × 105 خلايا / مل. قم بإضافة قطرة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية على منطقة القطب النشط في كل بئر من المجالات المتوسطة الحجم المكونة من 6 آبار. بالنسبة للأغطية ، قم بتخفيف الخلايا للحصول على تعليق خلوي 4.0 × 104 خلايا / مل. قم بإضافة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى آبار الصفيحة المكونة من 24 بئرا.
      ملاحظه: كثافة الخلايا النهائية في MEAs أعلى منها في الغطاء (الشكل 1 أ و ب). وجدنا أن هذه الكثافة العالية للخلايا كانت مطلوبة لتسجيل نشاط الشبكة بشكل صحيح. في البروتوكول ، يتم توفير الأرقام التي كانت مثالية للمقايسات.
    7. ضع المتوسط البيئي المكون من 6 آبار واللوحة ذات 24 بئرا في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ساعتين (MEAs) أو O / N (لوحة 24 بئرا).
    8. بعد ساعتين ، أضف بعناية 500 ميكرولتر من وسط E8 المحضر إلى كل بئر من المتوسط البيئي المكون من 6 آبار. ضع 6 آبار MEAs O / N في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو من 5٪ CO2.
  3. تغيير الوسيط (اليوم 2)
    1. في اليوم التالي، قم بإعداد DMEM/F12 مع 1٪ (v/v) N-2 الملحق و1٪ (v/v) من الأحماض الأمينية غير الأساسية، و1٪ (v/v) البنسلين/الستربتومايسين. يضاف التغذية العصبية المؤتلفة البشرية -3 (NT-3) إلى التركيز النهائي البالغ 10 نانوغرام / مل ، والعامل العصبي المؤتلف المشتق من الدماغ البشري (BDNF) إلى التركيز النهائي البالغ 10 نانوغرام / مل ، والدوكسيسيكلين إلى التركيز النهائي البالغ 4 ميكروغرام / مل. قم بتسخين المتوسط إلى 37 درجة مئوية.
    2. أضف اللامينين إلى التركيز النهائي البالغ 0.2 ميكروغرام / مل إلى الوسط. تصفية الوسيط الناتج. استنشق الوسط المستهلك من آبار المتوسط المتوسط المتوسط المكون من 6 آبار واللوحة المكونة من 24 بئرا واستبدله بالوسط المحضر. احتضان المتوسط البيئي المكون من 6 آبار ولوحة O / N ذات 24 بئرا في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2.
  4. أضف الخلايا النجمية للفئران (اليوم 3)
    ملاحظة:     تفترض المجلدات المذكورة في هذا البروتوكول أن الخلايا النجمية للفئران يتم استزراعها في قوارير ثقافة T75. من الأهمية بمكان أن تكون الخلايا النجمية للفئران التي تضاف إلى الثقافات ذات نوعية جيدة. نستخدم معيارين للتحقق مما إذا كانت الخلايا النجمية للفئران ذات نوعية جيدة. أولا ، يجب أن تكون ثقافة الخلايا النجمية للفئران قادرة على النمو في غضون عشرة أيام بعد العزلة عن أدمغة الفئران الجنينية. ثانيا ، بعد تقسيم ثقافة الخلايا النجمية للفئران ، يجب أن تكون الخلايا النجمية للفئران قادرة على تكوين طبقة أحادية التقاء والفسيفساء (الشكل 1 ج). إذا كانت ثقافة الخلايا النجمية للفئران لا تفي بهذين المعيارين ، فإننا ننصح بعدم استخدام هذه الثقافة لتجارب التمايز.
    1. قم بتسخين 0.05٪ التربسين - EDTA إلى RT. قم بتسخين DPBS و DMEM / F12 مع 1٪ (حجم / حجم) بنسلين / ستربتومايسين إلى 37 درجة مئوية.
    2. استنشق الوسط المستهلك لثقافة الخلايا النجمية للفئران. اغسل المزرعة بإضافة 5 مل DPBS وحركها برفق.
    3. شفط DPBS وأضف 5 مل 0.05٪ تريبسين-EDTA. حفي التربسين EDTA برفق. احتضن في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5 - 10 دقائق.
    4. تحقق تحت المجهر مما إذا كانت الخلايا منفصلة. افصل الخلايا الأخيرة عن طريق ضرب القارورة عدة مرات.
    5. أضف 5 مل من DMEM / F12 إلى القارورة. قم بتقطيع الخلايا برفق داخل القارورة باستخدام ماصة سعة 10 مل. اجمع معلق الخلية في أنبوب سعة 15 مل. قم بتدوير الأنبوب عند 200 × جم لمدة 8 دقائق.
    6. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من DMEM / F12. حدد عدد الخلايا (خلايا / مل) باستخدام غرفة مقياس الدم.
    7. أضف 7.5 × 104 خلايا نجمية لكل بئر من المتوسطيات البيئية المكونة من 6 آبار. أضف 2.0 × 104 خلايا نجمية لكل بئر من اللوحة المكونة من 24 بئرا. احتضان المتوسطات المتعددة الأطراف ولوحة O / N المكونة من 24 بئرا في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  5. تغيير الوسيط (اليوم 4)
    1. تحضير الوسط العصبي القاعدي مع 2٪ (حجم / حجم) مكمل B-27 ، و 1٪ (حجم / حجم) L-alanyl-L-glutamine و 1٪ (v / v) بنسلين / ستربتومايسين. أضف NT-3 إلى التركيز النهائي البالغ 10 نانوغرام / مل ، BDNF إلى التركيز النهائي 10 نانوغرام / مل ، والدوكسيسيكلين إلى التركيز النهائي 4 ميكروغرام / مل. بالإضافة إلى ذلك ، أضف السيتوزين β-D-arabinofuranoside بتركيز 2 ميكرومتر
      ملاحظة: يضاف السيتوزين β-D-arabinofuranoside إلى الوسط لمنع تكاثر الخلايا النجمية وقتل hiPSCs المتبقية التي لا تتمايز إلى خلايا عصبية.
    2. قم بتصفية الوسط والدافئ إلى 37 درجة مئوية. قم بشفط الوسط المستهلك من آبار MEAs المكونة من 6 آبار واللوحة المكونة من 24 بئرا واستبدله بالوسط المحضر. حافظ على المتوسطات البيئية المكونة من 6 آبار والصفيحة المكونة من 24 بئرا في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2.
  6. قم بتحديث الوسط (اليوم 6 - 28)
    ملاحظة:     بدءا من اليوم 6 ، قم بتحديث نصف الوسيط كل يومين. من اليوم 10 فصاعدا ، يتم استكمال الوسط ب FBS لدعم بقاء الخلايا النجمية.
    1. تحضير الوسط العصبي العصبي مع 2٪ (حجم / حجم) مكمل B-27 ، و 1٪ (v / v) L-alanyl-L-glutamine ، و 1٪ (v / v) البنسلين / الستربتومايسين. أضف NT-3 إلى التركيز النهائي البالغ 10 نانوغرام / مل ، BDNF إلى التركيز النهائي 10 نانوغرام / مل ، والدوكسيسيكلين إلى التركيز النهائي 4 ميكروغرام / مل. من اليوم 10 فصاعدا، استكمل الوسيط أيضا بنسبة 2.5٪ (v/v) FBS. قم بتصفية الوسط الناتج وتسخينه إلى 37 درجة مئوية.
    2. قم بإزالة نصف الوسط المستهلك من آبار المتوسط المتوسط المكون من 6 آبار واللوحة المكونة من 24 بئرا باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر واستبدله بالوسط المحضر. حافظ على المتوسطات البيئية المكونة من 6 آبار والصفيحة المكونة من 24 بئرا في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: تمايز hiPSC إلى الخلايا العصبية. A. ثلاث نقاط زمنية لتمايز hiPSCs إلى خلايا عصبية على الغطاء. ب. طلاء hiPSCs على MEAs. C. الخلايا النجمية عند التقاء 100٪ في قارورة T75 (لاحظ أن الخلايا تشكل طبقة أحادية الفسيفساء). قضبان المقياس: 150 ميكرومتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مكمل B-27 جيبكو 0080085 SA Ca2 + / Mg2 + خالية من HBSS جيبكو 14175-095 0.05 ٪ تريبسين EDTA جيبكو هاتف: 25300-054 2.5٪ تربسين جيبكو 15090-046 DMEM عالي الجلوكوز جيبكو 11965-092 FBS سيجما ألدريتش F2442-500 مل البنسلين / الستربتومايسين سيجما ألدريتش ص 4333 مصفاة خلية 70 ميكرومتر بي دي فالكون هاتف: 352350 DPBS جيبكو 14190-094 مصفوفة الغشاء القاعدي جيبكو A1413201 DMEM / F12 جيبكو 11320-074 حل انفصال الخلية سيجما ألدريتش أ6964 E8 متوسط جيبكو A1517001 مثبط الصخور جيبكو A2644501 بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مثبطات ROCK مثل الثيازوفيفين. 6-الآبار المتوسطية المتوسطية أنظمة متعددة القنوات 60-6wellMEA200 / 30iR-Ti-tcr أغطية زجاجية VWR 631-0899 بولي إل أورنيثين سيجما ألدريتش P3655-10 ملغ لامينين سيجما ألدريتش L2020-1MG دوكسيسيكلين سيجما ألدريتش D9891-5G مكمل N-2 جيبكو 17502-048 الأحماض الأمينية غير الأساسية سيجما ألدريتش M7145 NT-3 ، مؤتلف بشري بروموكين ج 66425 BDNF ، مؤتلف بشري بروموكين ج 66212 التربسين EDTA جيبكو هاتف: 25300-054 الوسط العصبي القاعدي جيبكو هاتف: 21103-049 السيتوزين β-د-أرابينوفورانوسيد سيجما ألدريتش C1768-100 ملغ

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Neurogenin 2

مقالات ذات صلة