تطوير كرات الخلايا العصبية باستخدام تقنية ثقافة القطرة المعلقة

Abstract

المصدر: Parvin، S. et al.، مقايسة تكوين ما قبل المشبكي باستخدام حبات منظم ما قبل المشبك وثقافة" كرة الخلايا العصبية".J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو عملية توليد كرات الخلايا العصبية باستخدام تقنية ثقافة القطرات المعلقة. داخل القطرات المعلقة ، تتحرك الخلايا نحو القاع ، ويتم تجميعها ذاتيا في هياكل ثلاثية الأبعاد تشكل كرات عصبية ، والتي يمكن استخدامها في الدراسات العصبية البيولوجية.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير كرات الخلايا العصبية كثقافة قطرة معلقة (أيام في المختبر (DIV) 0-3)

ملاحظة: تعتمد الإجراءات الموضحة هنا لإعداد ثقافة كرة الخلايا العصبية على الطريقة التي تم الإبلاغ عنها سابقا من قبل مجموعة ساساكي مع بعض التعديلات. اعتمدنا أيضا عدة إجراءات من طريقة Banker للثقافة المنفصلة.

1. التأكد مما يلي قبل البدء في التشريح
   1. تحضير جميع المحاليل المطلوبة وتعقيمها عن طريق الأوتوكلاف / الترشيح مسبقا.
   2. حافظ على استعداد لجميع الأدوات والمواد التي سيتم استخدامها في كل خطوة من خطوات ثقافة الخلايا العصبية القشرية.
   3. رش وامسح خزانة تدفق الهواء الرقائقي ، وطاولة التشريح ، ولوحة المسرح من المجهر المجسم ، والمقص ، والملقط بنسبة 70٪ من الإيثانول.
2. القتل الرحيم للفأر عند تطبيق ثاني أكسيد الكربون₂ وتشريح البطن للحصول على أجنة E16.
3. قم بإزالة الأدمغة من الأجنة بعناية بمساعدة أطراف دقيقة من الملقط ونقلها إلى أطباق زراعة الخلايا مقاس 60 مم تحتوي على 4 مل من حمض 4-(2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك ، محلول الملح المخزن HEPES (HBSS). < / > ملاحظه: يحتوي وسط التشريح HBSS على 10 ملي مولار HEPES (درجة الحموضة 7.4) ، و 140 ملي مولار كلوريد الصوديوم (NaCl) ، و 5.4 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، و 1.09 ملي مولار فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم (Na₂HPO₄) ، و 1.1 ملي مولار فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم (KH₂PO₄) ، و 5.6 ملي مولار D-glucose ، و 5.64 ميكرومولار من الفينول الأحمر.
4. قم بإزالة فروة الرأس ، وقطع البصلة الشمية ، وافصل القشرة من كل نصف كرة دماغي باستخدام الأطراف الدقيقة للملقط تحت مجهر مجسم ، وانقلها إلى أطباق أخرى مقاس 60 مم تحتوي على HBSS الطازج. استخدم ما لا يقل عن 3-5 أجنة لكل ثقافة كرة خلية عصبية منفصلة.
5. قطع القشرة إلى قطع صغيرة باستخدام مقص زنبركي تشريح دقيق في غطاء ثقافة خلية التدفق الرقائقي.
6. انقل القشرة المفرومة إلى أنبوب سعة 15 مل وقم بالتربسين بالقشرة المفرومة في 4 مل من 0.125٪ التربسين في HBSS لمدة 4.5 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية < br / > ملاحظه: يعد وقت التربسين هذا أمرا بالغ الأهمية لثقافة الخلايا العصبية الفعالة حيث يؤدي الوقت المتزايد (> 4.5 دقيقة) إلى العديد من الخلايا العصبية الميتة.
7. انقل مجاميع الخلية إلى أنبوب جديد سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من HBSS بواسطة ماصة نقل معقمة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
8. انقل مجاميع الخلايا إلى أنبوب جديد سعة 15 مل يحتوي على 2 مل من الوسائط العصبية القاعدية التي تحتوي على GlutaMax ، مكمل B27 (وسط NGB) ، 0.01٪ DNase I و 10٪ مصل الحصان.
9. قم بترتيث القشرة المثقببة عن طريق ماصتها بشكل متكرر لأعلى ولأسفل (3-5 مرات) باستخدام ماصة باستور زجاجية ناعمة مصقولة بالنار. < / > ملاحظه: قطر ماصة باستور الزجاجية الناعمة المصقولة بالنار مهم جدا كما هو موضح في ورقة طريقة Banker. إذا كانت الماصة ضيقة جدا بحيث لا يمكن تمرير القشرية، فقم بإعداد ماصات تحتوي على 2-3 أحجام مختلفة، وجرب من ماصة أكبر.
10. لتحضير كرات الخلايا العصبية ، خذ تعليق الخلية أعلاه واضبط كثافة الخلية على 1 × 10⁶ خلايا / مل باستخدام وسط NGB.
11. استزراع الخلايا العصبية القشرية كقطرات معلقة تحتوي على 10,000 خلية / قطرة (قطرة واحدة تساوي 10 ميكرولتر) داخل الجفون العلوية لأطباق الثقافة 10 سم.
12. أضف 7 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) إلى الجزء السفلي من أطباق الاستزراع ، ثم احتفظ بها في حاضنة لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في ظروف رطبة للسماح بتكوين كرة الخلايا العصبية.

Materials