$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تحضير ثقافة الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية البالغة المنفصلة أو الخلايا العصبية DRG
- قبل إعداد الثقافة ، قم بتغطية صفيحة مكونة من 6 آبار مسبقا ب poly-D-lysine واللامينين. احتضان صفيحة 6 آبار مع 0.01٪ بولي د-ليسين عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين أو عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. ثم اغسل الطبق مرتين بالماء المقطر.
- احتضان اللوحة بمحلول اللامينين بتركيز 3 ميكروغرام / مل لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسل اللوحة مرتين بالماء المقطر. جفف الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
- القتل الرحيم للفأر في غرفة شفافة من ثاني أكسيد الكربون2 متصلة بأسطوانة غاز CO2 مضغوطة. شق الجلد المغطى بالعمود الفقري بشفرة جراحية وتشريح العضلات المجاورة للفقرات بشكل ثنائي لكشف عظام العمود الفقري. قم بإزالة عظام العمود الفقري بدقة باستخدام rongeur جراحي ضيق الرأس حتى تتعرض DRGs بالكامل.
ملاحظه: يتم الحصول على الخلايا العصبية DRG البالغة من ذكور C57BL6 البالغة التي تتراوح أعمارها بين 8 أسابيع و 12 أسبوعا.
- قم بإزالة DRGs بشكل ثنائي من S1 وصولا إلى المستوى C1 باستخدام مقص استئصال القزحية والملقط ذو الرؤوس الدقيقة تحت مجهر تشريح. حاول قطع الجذور تماما من DRGs لتقليل تلوث خلايا Schwann أو الخلايا الليفية.
- قم بتخزين DRGs التي تم تشريحها في طبق بتري مقاس 60 مم يحتوي على 5 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) البارد على الجليد حتى تكون جميع DRGs هي الخطوة التالية ، حتى لو كان لا يزال هناك DRGs متبق><ية.
ملاحظه: من الأهمية بمكان تشريح DRGs في أسرع وقت ممكن. يجب ألا يستغرق جمع جميع DRGs من ماوس واحد أكثر من 30 دقيقة بعد القتل الرحيم، توقف عن جمع DRGs وانتقل إلى نقل DRGs إلى أنبوب Eppendorf سعة 1.5 مل باستخدام طرف ماصة أزرق (1000 ميكرولتر) بنهاية مقطوعة. قم بإزالة DMEM بعد دوران سريع لعدة ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي صغير. أضف 1 مل من DMEM يحتوي على 125 U / مل من النوع XI كولاجيناز واحتضان الأنبوب لمدة 90 دقيقة مع دوران لطيف (35-40 دورة في الدقيقة) باستخدام شاكر الإعصار في حاضنة 37 درجة مئوية. شل حركة الأنبوب على أرضية شاكر باستخدام الشريط.
- تخلص من DMEM المحتوي على الكولاجيناز وأضف 1 مل من DMEM الطازج. انتظر حتى تغرق DRGs العائمة تماما إلى الأسفل ، ثم قم بإزالة DMEM مع بقايا الأنسجة. كرر خطوة الغسيل هذه ست مرات على الأقل.
ملاحظه: لا تحاول التخلص من المادة الطافية تماما. احرص على عدم إزالة أي DRGs باستخدام مادة DMEM الطافية.
- انقل DRGs إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام طرف ماصة أزرق (1000 ميكرولتر) بنهاية قطع. ثم قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل برفق 15 مرة على الأقل باستخدام طرف أزرق (1000 ميكرولتر) لعمل معلق خلوي متجانس. تجنب صنع الفقاعات وحاول ألا تلمس الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي بطرف ماصة.
قم - بالطرد المركزي للأنبوب عند 239 × جم لمدة 3 دقائق وتخلص بعناية من المادة الطافية بالحطام العائم. أضف 1 مل من الوسط العصبي المكمل ب B27 (2.0٪ حجم / حجم) وأعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل من 5 إلى 10 مرات.
- مرر معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر مغطاة فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل. انتظر لمدة دقيقتين ، ثم اسكب وسط Neurobasal / B-27 على المصفاة باستخدام وحدة تحكم في الماصة.
- لوحة جميع الخلايا العصبية DRG التي تم جمعها (حوالي 2 × 106 خلايا عصبية DRG من فأر واحد) على بئرين من صفيحة 6 آبار. تغطي الخلايا العصبية DRG من فأر بالغ بئرين في صفيحة من 6 آبار. ثم ضع اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية حتى تزرع البلاعم المشتركة.
< p class = "jove_title" >2. الزراعة المشتركة للضامة البريتونية الأولية على إدراج ثقافة الخلية
ملاحظة: قم بإنشاء الثقافات المشتركة بعد 4 ساعات من الطلاء الأولي للخلايا العصبية DRG المنفصلة
- يتم تحضير البلاعم البريتونية الأولية من ذكور C57BL6 البالغة التي تتراوح أعمارها بين 8 أسابيع و 12 أسبوعا. القتل الرحيم لحيوان في حجرة CO2. شق جلد البطن برفق ، وكشف الصفاق ، وتجنب قطع الصفاق لمنع تسرب سائل الغسيل.
- ثقب الصفاق باستخدام حقنة بإبرة 22G وحقن 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS) في التجويف البريتوني. قم بتدليك الصفاق بلطف لمدة 1-2 دقيقة. بعد ذلك ، اسحب الإبرة واضغط على PBS من خلال موقع ثقب الإبرة ، واجمع سائل الغسيل في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
ملاحظه: قبل الاستخدام ، ضع المحقنة على الثلج للحفاظ على برودة PBS.
- الطرد المركزي لسائل الغسيل عند 239 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات المكونات الخلوية. أعد تعليق الحبيبات ب 3 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية مرة أخرى عند 239 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات ب 3 مل من PBS وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية مرة أخرى لإزالة أي مخزن مؤقت متبقي لتحلل كرات الدم الحمراء.
ملاحظه: تأكد من إزالة المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء بالكامل. وإلا فقد يكون المخزن المؤقت المتبقي لتحلل كرات الدم الحمراء ساما للبلاعم المستزرعة.
- أعد تعليق الخلايا المحببة في 1 مل من وسط Neurobasal / B-27. صفيحة نصف جميع البلاعم التي تم جمعها (ما مجموعه 3 × 106 إلى 6 × 106 خلية) على إدراج ثقافة خلية بمساحة فعالة تبلغ 4.2 سم2 ، والتي توضع فوق بئر DRG.
المنفصلة
ملاحظه: خلال فترة الزراعة المشتركة ، تزرع البلاعم في وسط ثقافة الخلايا العصبية العصبية العصبية / B-27. تم تأكيد بقاء كاف للبلاعم في ظل هذه الحالة.
< p class = "jove_title" >3. معالجة db-cAMP (ثنائي بوتيريل حلقي AMP) ومجموعة البلاعم CM
ملاحظة: ابدأ علاج db-cAMP بعد 4 ساعات من الثقافات المشتركة بين الخلايا العصبية والبلاعم.
- أضف 2 ميكرولتر من محلول 100 ميكرومتر ديسيبل-cAMP إلى الثقافات المشتركة بين الخلايا العصبية والبلاعم. أضف نفس وحدة تخزين PBS لتجربة التحكم.
- بعد 24 ساعة ، املأ بئرا فارغة ب 1 مل من وسط زراعة البلاعم في نفس اللوحة المكونة من 6 آبار. انقل إدراج ثقافة الخلية في الثقافات المشتركة بين الخلايا العصبية والبلاعم إلى البئر الفارغ باستخدام وسط زراعة البلاعم. احتفظ بالخلايا في نفس الحالة لمدة 72 ساعة دون تغيير الوسيط.
ملاحظه: نضيف 1 مل فقط من وسط زراعة البلاعم أثناء جمع CM لصنع CM مركز. أثناء مجموعة CM ، إذا لزم الأمر ، أضفنا المزيد لتغطية البلاعم بالكامل داخل الإدراج.
- بعد 72 ساعة ، قم بالطرد المركزي للبلاعم CM عند 239 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة المكونات الخلوية. مرر المادة الطافية عبر مرشح 0.2 ميكرومتر لإزالة أي حطام خلوي متبقي. قم بتخزين CM الذي تم جمعه عند -70 درجة مئوية حتى الاستخدام.