مقالة منهجية

استخدام وسيط مكيف للبلاعم لتعزيز امتدادات الخلايا العصبية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Yun ، H. J. ، et al. الثقافات المشتركة بين الخلايا العصبية والبلاعم لتنشيط البلاعم التي تفرز العوامل الجزيئية مع نشاط نمو العصبية. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو فحصا لتعزيز نمو إسقاطات الخلايا العصبية المعروفة باسم نمو الخلايا العصبية باستخدام الوسط المكيف بالبلاعم. الزراعة المشتركة للخلايا العصبية والضامة مع cAMP وحصاد الوسط المكيف المشتق من البلاعم. تؤدي زراعة الخلايا العصبية ذات الوسط المكيف إلى تعزيز نمو الخلايا العصبية. يتم تصنيف هذه النتوءات بالفلورسنت وتصورها باستخدام المجهر الفلوري.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. معالجة Db-Camp وجمع الوسط المكيف للبلاعم

< p class = "jove_content" >ملاحظة: ابدأ علاج db-cAMP بعد 4 ساعات من الثقافات المشتركة بين الخلايا العصبية والبلاعم.

  1. أضف 2 ميكرولتر من محلول ثنائي بوتيريل الدوري 100 ميكرومتر (db-cAMP) إلى الثقافات المشتركة بين الخلايا العصبية والبلاعم. أضف نفس الحجم من الملح المخزن بالفوسفات (PBS) لتجربة تحكم.
  2. بعد 24 ساعة ، املأ بئرا فارغة ب 1 مل من وسط زراعة البلاعم في نفس اللوحة المكونة من 6 آبار. نقل إدراج ثقافة الخلية في الثقافات المشتركة بين الخلايا العصبية والبلاعم إلى البئر الفارغ باستخدام وسط زراعة البلاعم. احتفظ بالخلايا في نفس الحالة لمدة 72 ساعة دون تغيير الوسط.
    ملاحظه: نضيف 1 مل فقط من وسط زراعة البلاعم أثناء جمع الوسط المكيف (CM) لصنع CM مركز. أثناء مجموعة CM ، إذا لزم الأمر ، أضفنا المزيد لتغطية البلاعم بالكامل داخل الإدراج.
  3. بعد 72 ساعة ، قم بالطرد المركزي للبلاعم CM عند 239 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة المكونات الخلوية. مرر المادة الطافية عبر مرشح 0.2 ميكرومتر لإزالة أي حطام خلوي متبقي. قم بتخزين CM الذي تم جمعه عند -70 درجة مئوية حتى الاستخدام.
< p class = "jove_title" >2. مقايسة نمو Neurite مع CM المجمعة

  1. قبل إعداد ثقافة الخلايا العصبية DRG البالغة المنفصلة ، قم بتغطية شريحة غرفة مكونة من 8 آبار مسبقا باستخدام بولي دي ليسين واللامينين. احتضان صفيحة 6 آبار مع 0.01٪ بولي د-ليسين عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين أو عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. ثم اغسل الطبق مرتين بالماء المقطر.
  2. احتضان اللوحة بمحلول اللامينين بتركيز 3 ميكروغرام / مل لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسل اللوحة مرتين بالماء المقطر. جفف الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
  3. الحصول على الخلايا العصبية DRG البالغة المنفصلة في الوسط العصبي القاعدي المكمل ب B27. لوحة 5 × 104 خلايا لكل بئر على شريحة الغرفة المكونة من 8 آبار المطلية مسبقا.
  4. ضع شريحة الغرفة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، مما يسمح للخلايا بالالتصاق بالأسفل. بعد ذلك ، استبدل وسط الاستزراع بسم المذاب الذي يتم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية < br / > ملاحظه: احرص على عدم لمس الجزء السفلي من شريحة الغرفة المكونة من 8 آبار عند إزالة وسط الثقافة وإضافة CM الذي تم جمعه.
  5. بعد 15 ساعة من الطلاء الأولي ، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا باستخدام PBS مرة واحدة. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهيد المثلج البارد بنسبة 4٪ إلى الآبار ، واحتضان الخلايا بمحلول بارافورمالدهايد لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية < br / > ملاحظه: يجب أن تقتصر ثقافة الخلايا العصبية DRG لمقايسة نمو الخلايا العصبية بدقة على 15 ساعة. في ظل هذه الحالة ، لا يوجد نمو عصبي ملحوظ.
  6. اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS المثلج ثم قم بإجراء الحجب باستخدام مصل الماعز العادي بنسبة 10٪ (NGS) مع 0.1٪ Triton-X لمدة 30 دقيقة.
  7. اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS ، ثم احتضن الخلايا بمحلول الجسم المضاد الثانوي (الماعز المضاد للفأر) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل مرتين باستخدام PBS وقم بتركيب شريحة الثقافة بغطاء (24 × 50 مم) باستخدام محلول تثبيت.
  8. التقط صورا باستخدام المجهر الفلوري لتصور نمو العصبة (الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: النتائج التمثيلية لمقايسة نمو العصبيات باستخدام وسط مشروط تم الحصول عليه من ظروف مختلفة. (أ ، ب) تم فصل الخلايا العصبية DRG البالغة بشكل حاد واستزراعها لمدة 15 ساعة بالضبط بعد 2 ساعة من الطلاء ، تم استبدال وسط الثقافة بوسط مكيف (CM) تم الحصول عليه من الثقافات المشتركة للخلايا العصبية والضامة المعالجة إما ب PBS (A) أو dibutyryl cAMP (db-cAMP) (B). فقط CM المعالج ب db-cAMP أظهر نشاطا قويا لنمو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات إدراج ثقافة الخلية غشاء PET شفاف بحجم المسام 0.4 ميكرومتر كورنينج ، فالكون 353090 غشاء PET شفاف بحجم مسام 0.4 ميكرومتر ، للوحة 6 آبار مصفاة خلايا النايلون 70 ميكرومتر كورنينج ، فالكون هاتف: 352350 8-آبار ثقافة الشريحة بيوكوت 354632 مع تطبيق موحد من بولي دي يسين الوسط العصبي القاعدي ثيرمو فيشر العلمي ، جيبكو هاتف: 21103-049 يحتوي على 1٪ جلوتاماكس و 1٪ بنيسيلين ستربتومايسين مكمل B-27 ، خال من المصل ثيرمو فيشر العلمي ، جيبكو 17504-044 حل خارج الخلية جلوتاماكس ثيرمو فيشر العلمي ، جيبكو 35050-061 البنسلين - ستربتومايسين ثيرمو فيشر العلمي ، جيبكو 15140-122 بولي دي ليسين هيدروبروميد سيجما ألدريتش P6407-5 ملغ لامينين ثيرمو فيشر العلمي ، Invitrogen 23017-015 الأدينوزين 3 '، 5'-أحادي الفوسفات الدوري ، N6 ، O2'-dibutyryl- ، ملح الصوديوم شركة ميرك ميليبور ، كالبيوكيم هاتف: 28745 10٪ مصل ماعز عادي ثيرمو فيشر العلمي 16210072 تريتون-X-100 شركة دايجونج للكيماويات والمعادن 8566-4405 التوبولين المضاد β III (Tuj-1) شركة بروميجا جي 7121 الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر الجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للفأر (H + L) ثيرمو فيشر العلمي ، Invitrogen أ 11005 مقياس الدم مارينفيلد سوبيريور غير متاح حاضنة CO2 لزراعة الخلايا باناسونيك غير متاح جهاز طرد مركزي منضدية سورفال غير متاح مجهر متحد البؤر أوليمبوس أمريكا IX71 FBS (مصل الأبقار الجنينية) VWR الدولية ، Hyclone SH30919.03

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

cAMP

مقالات ذات صلة