تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
فئة
1. غرفة الموائع الدقيقة أو تحضير MFC
- صب PDMS في القوالب الأولية (الشكل 1)
- قم بشراء أو إنشاء قوالب أولية (رقائق) باتباع بروتوكول مفصل.
- استخدم الهواء المضغوط لإزالة أي نوع من الأوساخ من منصة الرقاقة قبل المتابعة إلى خطوة الطلاء. يجب أن يبدو سطح الرقائق أملسا وواضحا.
- املأ وعاءا ب 50 مل من النيتروجين السائل. تحضير حقنة 10 مل وإبرة 23 جم.
ملاحظه: يجب تنفيذ جميع الإجراءات من هذه الخطوة إلى الأمام في غطاء كيميائي.
- في الغطاء الكيميائي ، استخدم المحقنة والإبرة لتجميع 2 مل من النيتروجين السائل. على الرغم من أنه قد يبدو وكأن الهواء قد تم سحبه ، إلا أن المحقنة مملوءة بالنيتروجين (الشكل 1 أ). ضع اللوحة المحتوية على الرقاقة في وعاء قابل للغلق.
- افتح زجاجة كلوروتري ميثيل سيلان ، واثقب الغطاء المطاطي باستخدام المحقنة المملوءة بالنيتروجين ، وقم بحقن محتويات المحقنة بالكامل في الزجاجة. دون سحب الإبرة ، اقلب الزجاجة رأسا على عقب واسحب 2 مل من الكلوروتريميثيل سيلان.
ملاحظه: بسبب ضغط المحقنة ، يتم رش كمية صغيرة من الكلوروتريميثيل سيلان من الإبرة. لتجنب الخطر ، وجه الإبرة نحو الجدار الداخلي للغطاء (الشكل 1 ب).
- انشر كلوروتريميثيل سيلان بشكل موحد في الحاوية (من الخطوة 1.1.4) ، ولكن ليس مباشرة على الرقاقة أو اللوحة المحتوية على الرقاقة. أغلق الحاوية واحتضنها لمدة 5 دقائق لكل رقاقة.
ملاحظه: إذا كانت هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها طلاء الرقاقة بالكلوروتريميثيل سيلان ، فيجب السماح بحضانة لمدة ساعة واحدة لكل رقاقة.
- لا تخرج الرقائق والحاوية من الغطاء الكيميائي لمدة 30 دقيقة < / >
أنذر: كلوروتري ميثيل سيلان شديد التقلب.
- قم بوزن قاعدة PDMS (انظر جدول المواد) في أنبوب سعة 50 مل وأضف عامل معالجة PDMS بنسبة 16: 1 ، على التوالي (على سبيل المثال ، 47.05 جم من القاعدة و 2.95 جم من عامل المعالجة). امزج لمدة 10 دقائق باستخدام دوار منخفض السرعة.
- صب PDMS في كل صفيحة تحتوي على رقاقة إلى الارتفاع المطلوب (الشكل 1C).
ملاحظه: يؤدي استخدام غرف الموائع الدقيقة الرقيقة (حتى 3-4 مم) إلى تحسين الالتصاق بطبق الثقافة ومنع التسرب.
- ضع جميع الألواح معا داخل مجفف فراغ لمدة ساعتين (الشكل 1E). تزيل هذه العملية الهواء المحاصر داخل نظام إدارة الإمداد الرقمي ، وبالتالي القضاء على فقاعات الهواء وتشكيل قالب واضح وموحد.
- ضع الأطباق داخل الفرن لمدة 3 ساعات (أو طوال الليل) عند 70 درجة مئوية (الشكل 1E).
ملاحظه: يجب أن تكون الألواح مستوية عند وضعها في الفرن.
- صب PDMS في قوالب الايبوكسي
ملاحظه: نظرا لأن تحضير الرقاقة مكلف ، ويتطلب معدات خاصة ، وقد يتلف الرقائق الهشة ، فمن الممكن إنشاء نسخ متماثلة من الإيبوكسي من الرقائق. النسخ المتماثلة أرخص وأكثر متانة ويمكن استخدامها للإنتاج الضخم لغرف الموائع الدقيقة.
- صب وعلاج PDMS (كما هو موضح في 1.1.8-1.1.11) في الرقاقة الأصلية.
- قم بإزالة وقطع الأجزاء الزائدة من PDMS مع ترك العناصر الدقيقة فقط والمنطقة الوظيفية المطلوبة لمعالجتها في غرف الموائع الدقيقة.
لف - PDMS على الفور بشريط سميك ولزج لمنعه من تراكم الغبار.
- اختر طبقا بلاستيكيا من فئة زراعة الأنسجة يناسب نظام إدارة الأنسجة بالكامل بالداخل واترك مساحة للإيبوكسي حوله. يجب أن تكون المسافة من PDMS إلى الطبق البلاستيكي أقل من 5 مم.
- تحضير كمية صغيرة من PDMS مختلطة بنسبة 10: 1 (القاعدة: عامل المعالجة). سيتم استخدام PDMS السائل الطازج للصق PDMS الصلب في قاع اللوحة البلاستيكية.
- ضع كمية قليلة من PDMS السائل على الجزء السفلي الأوسط من اللوحة البلاستيكية ثم قم بإزالة الشريط اللاصق من PDMS وألصقه بقاع الطبق البلاستيكي. تأكد من أن عناصر الموائع الدقيقة متجهة لأعلى.
- دع PDMS يعالج لمدة 30 دقيقة في فرن 70 درجة مئوية.
- تحضير راتنجات الايبوكسي عن طريق خلط القاعدة وعامل المعالجة بنسبة 100:45 ، على التوالي في أنبوب اختبار. قد يكون لراتنجات الايبوكسي المختلفة نسب خلط مختلفة. الحجم المطلوب للوحة عادية 100 مم هو حوالي 40 مل.
- دع الإيبوكسي يمتزج جيدا لمدة 10 دقائق في دوار حتى يصبح الخليط متجانسا بشكل واضح (أي لا توجد قطع أثرية مرئية تشبه الألياف في السائل).
قم - بالطرد المركزي لخليط الإيبوكسي على حرارة 400 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة فقاعات الهواء العالقة بالداخل.
- أثناء الطرد المركزي ، انشر طبقة رقيقة من شحم السيليكون حول الجدران وجميع الأجزاء البلاستيكية المكشوفة الأخرى من طبق الثقافة. سيمنع ذلك الإيبوكسي من البلمرة مع بلاستيك الطبق وسيمكن من إزالة الإيبوكسي المعالج بسهولة في نهاية البروتوكول.
- صب الإيبوكسي ببطء في الطبق حتى يغطي PDMS بالكامل ويتجاوزه بمقدار 5 مم على الأقل. ضع اللوحة في مكان آمن حتى لا يتم تحريكها لمدة 48 ساعة قادمة.
- بعد 48 ساعة يجب علاج الايبوكسي تماما. أدخل الطبق في فرن محمى على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 3 ساعات للمعالجة النهائية.
- قم بإزالة الإيبوكسي المعالج من اللوحة وقالب PDMS الأصلي عن طريق سحب الجدار البلاستيكي للوحة برفق حتى ينكسر. يجب بعد ذلك فصله بسهولة عن الإيبوكسي وتقشيره.
- بمجرد استخراجه ، امسح الشحوم المتبقية من نسخة الإيبوكسي الجديدة وقم بإدخالها رأسا على عقب (أي مع توجيه العناصر الدقيقة المكررة لأعلى) في طبق ثقافة جديد. النسخة المتماثلة من الإيبوكسي جاهزة الآن لصب PDMS.
- استخدم الهواء المضغوط أو N2 لتفجير أي بقايا من PDMS أو الأوساخ من قالب الإيبوكسي وشطفه مرتين باستخدام الأيزوبروبانول. املأها مرة ثالثة واحتضنها لمدة 10 دقائق على لوحة شاكر مدارية. شطف القالب مرة أخرى 3 مرات مع الأيزوبروبانول والتخلص من السائل المتبقي. يجفف بالهواء أو N2 أو يوضع في فرن 70 درجة مئوية حتى يجف.
ملاحظه: اتبع إجراءات السلامة عند العمل مع الأيزوبروبانول والتخلص منه.
- احتفظ بألواح القالب مغلقة حتى الصب. اتبع الخطوات 1.1.8.-1.1.11.
- تثقيب ونحت PDMS في MFC (الشكل 2)
- قم بقص وإزالة قالب PDMS من اللوحة باتباع العلامات (+) على الرقائق باستخدام مشرط. لا تستخدم القوة ، لأن القوالب هشة (الشكل 2 أ).
- اتبع التعليمات المرسومة على الرسم لكمة الغرف وقطعها اعتمادا على الإعداد التجريبي (الشكل 2B-F).
- بالنسبة لثقافة نبتة الحبل الشوكي (الشكل 2C ، E) ، قم بثقب بئرين بحجم 7 مم في الجانب البعيد من MFC الكبير. حدد موقع الآبار بطريقة تتداخل مع حواف القناة. على الجانب القريب ، قم بثقب 7 مم جيدا في منتصف القناة ، مع الحد الأدنى من التداخل ، بحيث يتم ترك مساحة كافية للنباتات. قم بعمل فتحتين إضافيتين بحجم 1 مم في حافتي القناة القريبة. اقلب MFC بحيث تكون العناصر الموائع الدقيقة متجهة لأعلى ، وباستخدام إبرة 20 جم ، قم بنحت ثلاثة كهوف صغيرة على البئر المثقوب 7 مم.
- بالنسبة لثقافة MN المنفصلة (الشكل 2D ، F) ، قم بعمل أربعة آبار مقاس 6 مم في حواف قناتي MFC صغير.
- تعقيم MFC لاستخدام زراعة الأنسجة
- انشر أشرطة لاصقة بطول 50 سم على المقعد. اضغط على الغرفة واسحبها للخلف لمواجهة الشريط اللاصق (الوجه العلوي والسفلي) وإزالة الأوساخ الخام. ضع الغرف النظيفة في طبق جديد مقاس 15 سم.
ملاحظه: لا تضغط مباشرة على عناصر الموائع الدقيقة عندما تكون متجهة لأعلى.
- احتضان الغرف في الدرجة التحليلية 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق على شاكر مداري.
- تخلص من الإيثانول وجفف الغرف في غطاء زراعة الأنسجة أو في فرن عند 70 درجة مئوية.
- وضع MFC على طبق زجاجي القاع
- ضع الغرفة في وسط طبق سفلي زجاجي بدرجة 35 مم / 50 مم وقم بتطبيق قوة طفيفة على الحواف لجعل PDMS وقاع الطبق ملتصقين. لتجنب كسر قاع الزجاج ، استخدم دائما القوة فوق سطح صلب.
- احتضن لمدة 10 دقائق عند 70 درجة مئوية. اضغط على الغرف لتقوية الالتصاق باللوحة.
- احتضن تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق.
- الطلاء والثقافة
- أضف 1.5 نانوغرام / مل بولي إل أورنيثين (PLO) إلى كلا الجزئين. تأكد من تشغيل PLO عبر القنوات عن طريق سحب وسائط الطلاء عدة مرات مباشرة في مدخل القناة.
- افحص غرفة الموائع الدقيقة تحت مجهر ضوئي بتكبير 10x للتحقق من وجود فقاعات الهواء. إذا كانت فقاعات الهواء تسد الأخاديد الصغيرة ، فضع MFC في مجفف فراغ لمدة دقيقتين. في وقت لاحق ، قم بإزالة الهواء الزائد الذي في القنوات عن طريق سحب وسائط الطلاء من خلالها. احتضن بين عشية وضحاها.
- يستعاض عن منظمة التحرير الفلسطينية بمادة اللامينين (3 ميكروغرام/مل في DDW) للحضانة الليلية بنفس الطريقة.
- قبل الطلاء ، اغسل اللامينين بوسط ثقافة عصبية.
< p class = "jove_title" >
2. طلاء الثقافة العصبية
- ثقافة نبتة الحبل الشوكي
- باستخدام مقص مستقيم وملقط دقيق، قم بتشريح الحبل الشوكي من جنين الفأر E12.5 ICR-HB9:GFP. العمل في محلول HBSS 1X مع 1٪ بنسلين ستربتومايسين (P / S) (الشكل 3A-C).
- باستخدام مقص التشريح المجهري ، قم بإزالة السحايا والقرون الظهرية (الشكل 3 د).
- قطع الحبل الشوكي إلى أقسام عرضية بسمك 1 مم (الشكل 3E). تخلص من جميع الوسائط من المقصورة القريبة من MFC.
- التقط نبتة واحدة من الحبل الشوكي بماصة بحجم إجمالي قدره 4 ميكرولتر. قم بحقن النبات في أقرب مكان ممكن من الكهف واسحب أي سائل زائد من البئر القريب عبر المنافذ الجانبية (لكمات 1 مم). يجب امتصاص النباتات في القناة القريبة.
- أضف ببطء 150 ميكرولتر من وسط نبات الحبل الشوكي (SCEX ، انظر جدول المواد والجدول 3) إلى البئر القريب.
- صيانة ثقافة نبات الحبل الشوكي
- أضف وسيط SCEX في الحجرة القريبة ووسط SCEX الغني (SCEX مع 50 نانوغرام / مل من BDNF و GDNF) في الحجرة البعيدة. حافظ على تدرج حجمي لا يقل عن 15 ميكرولتر لكل بئر بين الآبار البعيدة (الحجم الأكبر) والبئر القريب.
- قم بتحديث الوسيط كل يومين. يمكن أن يستغرق الأمر من 3-5 أيام للعبور بعيدا.
< p class = "jove_title" >
3. النقل المحوري (
الشكل 4 أ)
- وضع العلامات على الميتوكوندريا والمقصورات الحمضية
- قم بإعداد وسيط SCEX طازج (أو CNB ل MN المنفصل) يحتوي على 100 نانومتر Mitotracker Deep Red FM و 100 نانومتر LysoTracker Red. احتضن لمدة 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. يمكن استخدام ألوان أخرى طالما أن الفلوروفورات الخاصة بها لا تتداخل.
- اغسل 3x بوسط CNB / SCEX دافئ. اللوحات جاهزة للتصوير.
- التصوير المباشر
- احصل على 100 سلسلة صور بفاصل زمني من النقل المحوري على فترات 3 ثوان ، بإجمالي 5 دقائق لكل فيلم.
ملاحظه: تضمن نظام التصوير المستخدم في هذه الدراسة مجهرا مقلوبا مزودا بقرص دوار ، يتم التحكم فيه عن طريق برنامج تصوير الخلايا الملائمة ، وعدسة زيت 60x ، NA = 1.4 ، وكاميرا EMCCD. تم الحصول على الأفلام في بيئة خاضعة للرقابة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2.
ملاحظه: يمكن تصوير أفلام اللقطات المتتابعة الأطول أو الأقصر، حسب التجربة. حتى الأفلام الليلية يمكن تسجيلها إذا لزم الأمر. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان محاولة تقليل وقت التعرض وقوة الليزر ، بالإضافة إلى عدد الصور الإجمالية ، لتقليل السمية الضوئية والتبييض أثناء الحصول على الفيلم.
