عزل وثقافة الخلايا العصبية الأولية والدبقية من المثانة البولية للفئران

الملخص

المصدر: Wang، R. et al.، عزل وثقافة الخلايا العصبية الأولية والخلايا الدبقية من المثانة البولية للفئران البالغة. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو تقنية لتوليد ثقافة أولية للخلايا العصبية والخلايا الدبقية من المثانة البولية للفئران. يحدد الخطوات المتبعة في تحضير الأنسجة ، والهضم الأنزيمي للحصول على خلايا مفردة ، وزراعة الخلايا في وسط خاص بالخلايا العصبية لإنشاء ثقافة عصبية ودبقية أولية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير المواد

1. تعقيم جميع الأدوات و ddH₂O باستخدام الأوتوكلاف قبل إجراء التجربة. تشمل الأدوات على سبيل المثال لا الحصر المقص الجراحي ، ومقص العيون ، والملقط ، ومقسم نواة الملاعق ، والأطباق الزجاجية (قطرها 60-100 مم) ، والأكواب الزجاجية.
2. تحضير محلول كريبس (الجدول 1): قم بإذابة جميع المواد الكيميائية باستخدام ddH₂O قبل الاستخدام. قم بإذابة CaCI₂ بشكل منفصل وأضفه ببطء إلى المحلول المختلط مع التقليب لتجنب الرواسب.
3. تحضير وسائط الشطف ، والتي تتكون من وسائط F12 مع 10٪ مصل بقري جنين (FBS) و 1٪ مضاد حيوي / مضاد للفطريات (100x). أضف 5 مل من FBS و 0.5 مل من المضادات الحيوية / مضادات الفطريات إلى 44.5 مل من وسائط F12.
4. تحضير الخلايا العصبية الوسطى A ، والتي تتكون من الوسائط العصبية القاعدية A مع 2٪ B-27 ، و 1٪ FBS ، و 1٪ L-glutamine ، و 1٪ مضاد حيوي / مضاد للفطر (100x) ، و 0.1٪ عامل التغذية العصبية المشتق من الخلايا الدبقية (GDNF). أضف 200 ميكرولتر من B-27 ، و 100 ميكرولتر من FBS ، و 100 ميكرولتر من L-glutamine ، و 100 ميكرولتر من المضادات الحيوية / مضادات الفطريات (100x) ، و 10 ميكرولتر من GDNF (10 ميكروغرام / مل) إلى 9.5 مل من الوسائط العصبية القاعدية A.
   ملاحظه: تحضير وسائط الخلايا العصبية A في غضون أسبوع واحد من الاستخدام لضمان نضارة B-27 و L-glutamine و GDNF.
5. تحضير وسائط الخلايا العصبية B باستخدام نفس إجراء تحضير وسائط الخلايا العصبية A ولكن دون إضافة FBS.
6. تحضير محلول الهضم 1 عن طريق إذابة 20 مجم من الكولاجيناز من النوع الثاني ، و 6 مجم من ألبومين مصل الأبقار ، و 200 ميكرولتر من المضادات الحيوية / مضادات الفطريات (100x) في 10 مل من محلول كريبس المستقر بالأكسجين.
7. تحضير محلول الهضم 2 عن طريق تخفيف 1 مل من 0.25٪ تربسين مع 4 مل من محلول الملح المتوازن من هانك.
8. تحضير طبق مع أغطية مغلفة.
   1. استخدم الملقط في مقعد التدفق الصفحي عند وضع الغطاء الزجاجي في صفيحة ثقافة 48 بئرا.
   2. تمييع بولي د-ليسين مع ddH₂O إلى تركيز 0.1 ملغم/مل كمخزون بولي د-ليسين. قم بتخزين المرق في درجة حرارة -20 درجة مئوية ، ثم قم بإذابة الثلج قبل
   3. أضف 40 ميكرولتر من مخزون بولي دي ليسين فوق كل غطاء واحتضان المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق < / > ملاحظه: اضبط التركيز على 4 ميكروغرام / سم² لألواح مختلفة ذات مناطق قاعدية مختلفة. على سبيل المثال ، إذا كانت المساحة القاعدية لبئر واحد من صفيحة 24 بئرا 2 سم² ، فيجب أن ننقل 80 ميكرولتر من مخزون بولي د-ليسين في بئر. يحتوي كل سم² على 4 ميكروغرام من بولي د-ليسين.
   4. قم بإزالة poly-D-lysine في اللوحة المكونة من 48 بئرا ، واشطف الغطاء باستخدام ddH₂O ثلاث مرات.
   5. جفف اللوحة في غطاء التدفق الرقائقي لمدة 30 دقيقة على الأقل للتأكد من أن اللوحة غير مائية.
   6. قم بتخزين اللوحة عند 4 درجات مئوية قبل طلاء اللامينين لمدة يوم واحد على الأكثر. يفضل تخزين اللوحة عند -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
   7. قم بإذابة اللامينين عند 4 درجات مئوية. خفف اللامينين مع ddH₂O إلى تركيز 50 ميكروغرام / مل كمخزون لامينين. قم بتخزين المرق في درجة حرارة -20 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
   8. استخدم ماصة لنقل 100 ميكرولتر من اللامينين المخفف إلى الجزء العلوي من كل غطاء واحتضان اللامينين عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة < / > ملاحظه: اضبط التركيز على 5 ميكروغرام / سم² لألواح مختلفة ذات مناطق قاعدية مختلفة. على سبيل المثال ، إذا كانت المساحة القاعدية لبئر واحد من صفيحة 24 بئرا هي 2 سم² ، فقم بنقل 200 ميكرولتر من اللامينين المخفف إلى بئر. كل سم² يحتوي على 5 ميكروغرام من اللامينين.
   9. قم بإزالة محلول اللامينين ، واشطف الغطاء باستخدام ddH₂O مرة واحدة. قم بإجراء هذه العملية على حافة الغطاء لتجنب الكشط.
      ملاحظه: يمكن تخزين أغطية المغلفة عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين على الأكثر.

< ص الفئة = "jove_title" >2. حصاد المثانة

1. احصل على فئران Sprague-Dawley البالغة من العمر خمسة أسابيع.
2. قم بنقع الكربوجين (95٪ أكسجين ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) في محلول كريبس لمدة 30 دقيقة على الأقل في حمام جليدي للوصول إلى حالة أكسجين مستقرة ومستوى الأس الهيدروجيني.
3. بعد القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم ، انقع الفئران في 75٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية للتعقيم.
4. ضع الفئران على منشفة جراحية معقمة وفضح بطنها. افتح تجويف البطن واكشف عن المثانة بمجموعة من المقصات والملقط.
5. ارفع المثانة برفق واقطع المثانة من عنق المثانة بمجموعة أخرى من المقص والملقط لتجنب التلوث المتبادل. ضع المثانة بسرعة في محلول كريبس بارد ومستقر بالأكسجين لتحسين بقاء الخلايا.
   ملاحظه: بمجرد إزالة المثانة ، قم بإجراء العمليات التالية بسرعة لتحسين احتمالية بقاء الخلايا العصبية.
6. أضف محلول كريبس إلى ثلاثة أطباق زجاجية وأكواب زجاجية.
7. قم بإعداد الأطباق الزجاجية والأكواب بمحلول كريبس في حمام جليدي للتبريد المسبق.
8. ضع علامة على هذه الحاويات بالأرقام من 1 إلى 3 في المقابل لمنع الالتباس.
9. قم بإقران كل طبق زجاجي بالملقط ومقسم نواة الملاعق.
10. في الطبق الزجاجي 1 ، افتح المثانة بمقص العيون وافتحها بالملقط ومقسم نواة الملاعق.
11. اشطف المثانة في دورق زجاجي 1 وضعها في طبق زجاجي 2.
12. تخلص من الدهون الملتصقة على سطح الأنسجة باستخدام الملقط ومقص العيون في طبق زجاجي 2.
13. اشطف المثانة في دورق زجاجي 2 ، وضعها في طبق زجاجي 3.
14. اكشط المثانة برفق باستخدام الملقط ومقسم نواة الملاعق في الطبق الزجاجي 3 لإزالة المرفقات الخارجية.
15. اشطف المثانة في دورق زجاجي 3 ، وانقل المثانة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل مع 14 مل من محلول كريبس البارد ، وقم بتدوير العينة لمدة دقيقة واحدة عند 356 × جم و 4 درجات مئوية.
16. كرر الخطوة السابقة مرتين في أنبوبين آخرين بمحلول كريبس لتقليل التلوث.

< p class = "jove_title" >3. هضم المثانة بخطوتين

1. انقل المثانة من أنبوب الطرد المركزي إلى قارورة سعة 2 مل تحتوي على 1 مل من محلول الهضم 1. استخدم مقص العيون لتقطيع المثانة إلى قطع صغيرة (أصغر من 1 مم) في المحلول.
2. امزج محلول المثانة مع 9 مل من محلول الهضم 1 في طبق زراعة خلايا معقم (قطر 100 مم). قم بإجراء عملية الهضم الخطوة 1 في حاضنة رج لمدة ساعة واحدة تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ و 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.
3. بعد الخطوة 1 من الهضم ، قم بالطرد المركزي للمحلول عند 356 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق.
4. ضع محلول الهضم 2 في حمام مائي 37 درجة مئوية للتسخين المسبق.
5. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على محلول الهضم 1 وحصاد رواسب الخلية. يسمح ببعض السوائل المتبقية. قد تؤدي الإزالة الكاملة للمحلول إلى فقدان الخلايا.
6. امزج رواسب الخلايا مع محلول الهضم الدافئ 2 في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ورج الخليط أثناء الهضم في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. لا تتجاوز 7 دقائق من الخطوة 2 للهضم ، وإلا ستموت الخلايا العصبية.
7. بعد الهضم ، قم بإلغاء تنشيط التربسين على الفور في الخليط مع 10 مل من وسائط الشطف البارد.
   ملاحظه: قم بتنفيذ الخطوات التالية عند 0 درجة مئوية - 4 درجة مئوية. يمكن أن يوفر الحمام الجليدي مثل هذه الظروف.
8. احصد رواسب الخلية بعد الطرد المركزي عند 356 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسائط لأن التربسين المتبقي يضر بنمو الخلايا.
9. أعد تعليق الرواسب ب 3 مل من وسائط الخلايا العصبية برفق. تأكد من عدم إنشاء فقاعات الهواء في المحلول المحتوي على خلايا للحصول على معدل بقاء مرتفع.
10. قم بتصفية وسائط الخليط من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
11. احتفظ بالمرشح على شاكر عند 30 دورة في الدقيقة في حمام جليدي لمدة 30 دقيقة. هذه الخطوة ليست ضرورية ولكنها موصى بها.
12. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 356 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 8 دقائق ، وأعد تعليق كريات الخلية برفق في 1 مل من وسائط الخلايا العصبية A.
13. أضف 500 ميكرولتر من خليط الخلية إلى كل بئر من اللوحة المعدة المكونة من 48 بئرا.
14. خلايا الزراعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
15. استبدل جميع الوسائط بوسائط الخلايا العصبية B في 1 ساعة لتوفير ثقافة خالية من المصل.
16. قم بتغيير نصف وسائط الخلايا العصبية B كل 3 أيام.
    ملاحظه: الخلايا العصبية جاهزة للتجارب الكيميائية المناعية بعد 5-7 أيام من الزراعة.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. تكوين محلول كريبس

المكونات المولارية (ملليمتر) NaCI 120 حيا KCI 5.9 NaHCO₃ 25 نا₂HPO₄ · 12 ساعة₂O 1.2 MgCI₂ · 6 ساعات₂O 1.2 CaCI₂ 2.5 الجلوكوز 11.5

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.25٪ تربسين جيبيكو 15050065 هضم الإنزيم 48 بئر لوحة ثقافة كورنينج 3548 طبق طلاء مضاد حيوي / مضاد للفطريات جيبيكو 15240062 وسائط الثقافة / وسائط الشطف ب -27 جيبيكو 17504044 الإعلام الثقافي الكسر الخامس BSA جيبيكو 332 ريال هضم الإنزيم حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ هيريوس B16UU زراعة الخلايا الكولاجيناز النوع الثاني سيغما 2593923 هضم الإنزيم DMEM / F-12 جيبيكو 11330032 شطف الوسائط مصل الأبقار الجنينية جيبيكو 10100147 وسائط الثقافة / وسائط الشطف ملقط شنغهاي جين تشونغ الأجهزة الطبية 1383 10 سم ؛ عملية معقمة أكواب زجاجية أجهزة هوان تشيو الطبية 1101 50 مل عملية معقمة أغطية زجاجية WHB العلمية دبليو إتش بي -48-سي إس طبق طلاء أطباق زجاجية أجهزة هوان تشيو الطبية 1177 [1177] [م] 100 مم ؛ عملية معقمة مقعد التدفق الصفحي سو جي للأجهزة الطبية سي بي 1400 فولت عملية معقمة الفئران GDNF بيبروتك AF45044 الإعلام الثقافي Neurobasal-A وسط جيبيكو 10888022 الإعلام الثقافي مقص العيون شنغهاي جين تشونغ الأجهزة الطبية J21010 12.5 سم ؛ عملية معقمة الماصات إيبندورف 3120000240 100-1000 ul ؛ الكاشف والعينة الماصة الماصات إيبندورف 3120000267 10-100 ul ؛ الكاشف والعينة الماصة بولي دي ليسين سيغما P7280 طبق طلاء أجهزة الطرد المركزي المبردة أداة مروحة بينغ TGL-16A هضم الإنزيم حاضنة الاهتزاز أدوات مختبر هايمن كيلين بيل تي 8-1 هضم الإنزيم ملاعق مقسم النواة شنغهاي جين تشونغ الأجهزة الطبية يزار 030 12 سم ؛ عملية معقمة مقص جراحي شنغهاي جين تشونغ الأجهزة الطبية J21130 16 سم ؛ عملية معقمة منشفة جراحية فو كانغ الأجهزة الطبية 5002 40 × 50 سم ؛ عملية معقمة لامينين سيغما L2020 طبق طلاء ل-جلوتامين جيبيكو 25030081 الإعلام الثقافي