$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير وطلاء الرقائق متعددة الأقسام
- في خزانة السلامة الحيوية ، ضع الشريحة في طبق بتري أو حاوية معقمة أخرى مناسبة.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول الطلاء المسبق إلى البئر العلوي الأيسر للرقاقة واتركه يتدفق عبر القناة الرئيسية إلى البئر المجاور.
ملاحظه: يتم استخدام محلول الطلاء المسبق لطلاء قنوات الموائع الدقيقة مسبقا للتخلص من احتمالية حبس فقاعات الهواء داخل الشريحة.
- املأ الجزء السفلي الأيسر جيدا ب 100 ميكرولتر من محلول الطلاء المسبق. انتظر 5 دقائق للسماح للمحلول بالتدفق عبر الأخاديد الدقيقة.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول الطلاء المسبق إلى البئر العلوي الأيمن واتركه يتدفق عبر القناة الرئيسية إلى البئر المجاور. املأ الجزء السفلي الأيمن جيدا ب 100 ميكرولتر من محلول الطلاء المسبق.
- استنشق المحلول من كل بئر. استنشق بعيدا عن القنوات الرئيسية لتجنب إزالة السائل من القنوات الرئيسية (الشكل 1 أ). أضف على الفور 150 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) إلى البئر العلوي الأيسر. انتظر 1.5 دقيقة < / >
أنذر: لا تستنشق كل السوائل من القنوات الرئيسية المغلقة.
- أضف 150 ميكرولتر من PBS إلى البئر السفلي الأيسر. انتظر 5 دقائق للسماح للسوائل بالتدفق عبر الأخاديد الدقيقة. أضف 150 ميكرولتر PBS إلى البئر العلوي الأيمن. أضف 150 ميكرولتر PBS إلى البئر السفلي الأيمن. انتظر 10 دقائق.
- كرر الخطوات 1.5-1.6 لغسل PBS ثان.
- افحص الشريحة تحت مجهر زراعة الأنسجة بحثا عن فقاعات في القنوات الرئيسية. في حالة وجود فقاعات، قم بتنفيذ الإجراءات أدناه. في حالة عدم وجود فقاعات، انتقل إلى الخطوة 1.9.
- قم بشفط PBS من الآبار ، مع توجيه طرف الماصة بعيدا عن فتحة القناة (الشكل 1 أ).
- قم بتوزيع 100 ميكرولتر من محلول الطلاء المسبق في البئر العلوي ، مع توجيه طرف الماصة بالقرب من فتحة القناة (الشكل 1 ب). يجب أن تتحرك الفقاعات عبر القناة إلى البئر السفلي. انتظر 1.5 دقيقة.
- كرر الخطوات 1.3-1.8.
- قم بشفط PBS من الآبار ، مع توجيه طرف الماصة بعيدا عن فتحة القناة (الشكل 1 أ).
- أضف 100 ميكرولتر من 0.5 مجم / مل بولي د-ليسين (PDL) إلى البئر العلوي الأيسر من الشريحة. انتظر 1.5 دقيقة. املأ الجزء السفلي الأيسر جيدا ب 100 ميكرولتر من PDL.
- أضف 100 ميكرولتر من PDL إلى البئر العلوي الأيمن من الشريحة. انتظر 1.5 دقيقة. أضف 100 ميكرولتر إلى البئر السفلي الأيمن.
- أغلق طبق بتري وضع الشريحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- كرر خطوات غسيل PBS من 1.5 إلى 1.6 مرتين لإزالة PDL الزائد.
- استنشق PBS من الجهاز.
- أضف على الفور 100 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا إلى البئر العلوي الأيسر من الشريحة. انتظر 1.5 دقيقة. أضف الوسائط إلى أسفل اليسار جيدا. أضف الوسائط إلى الجزء العلوي الأيمن جيدا. انتظر 1.5 دقيقة. أضف 100 ميكرولتر متوسط إلى البئر الأيمن السفلي من الشريحة.
- ضع الشريحة في الحاضنة 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لألواح الخلايا.
< p class = "jove_title" >
2. بذر الخلايا العصبية في رقائق متعددة الأقسام
- تحضير تعليق الخلية للخلايا العصبية في الحصين الفئران المنفصلة وفقا للبروتوكولات المعمول بها لإنتاج كثافة ~ 12 × 106 خلايا / مل
ملاحظه: يمكن استخدام كثافة تعليق الخلية بين 3 و 12 × 106 خلايا / مل. إذا تم استخدام كثافة أقل ، فقد يتم زيادة حجم تعليق الخلية المراد إضافته إلى الشريحة. الإجراء الموضح أدناه قابل للتطبيق على الخلايا العصبية القشرية أو الحصينية المنفصلة في الفئران. قد تختلف كثافة الخلايا المثلى لأنواع الخلايا العصبية الأخرى.
- قم بإزالة غالبية الوسائط في كل بئر من الرقاقة ، مع ترك ما يقرب من 5 ميكرولتر في كل بئر. استنشق بعيدا عن القنوات الرئيسية لتجنب إزالة السائل من القنوات الرئيسية (الشكل 1 أ).
أنذر: لا تشحذ السائل من القنوات الرئيسية المغلقة. قد تصبح فقاعات الهواء محاصرة في الرقاقة إذا تم شفط السائل من القنوات الرئيسية.
- قم بتحميل 5 ميكرولتر من تعليق الخلية في البئر العلوي الأيمن و 5 ميكرولتر أخرى من تعليق الخلية في البئر الأيمن السفلي (~ 120,000 خلية إجمالا). قم بتحميل الخلايا عن طريق توزيعها بالقرب من القناة الرئيسية (الشكل 1 ب). تحقق تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا العصبية في القناة الرئيسية. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا بالإرفاق.
ملاحظه: يمكن تحميل الخلايا العصبية في أي من الجزءات. لأغراض الشرح ، فإن المقصورة الجسدية هي القناة الرئيسية على الجانب الأيمن ، ولكن يمكن استخدام أي من المقصورتين كحجرة جسدية. من الممكن استخدام كثافة الخلايا المنخفضة التي تصل إلى 60,000 خلية لكل شريحة. يمكن إضافة ما يصل إلى 10 ميكرولتر من معلق الخلية إلى كل بئر من الحجرة الجسدية مع معلق خلوي به خلايا أقل مما هو موضح أعلاه.
- أضف ما يقرب من 150 ميكرولتر من وسائط الثقافة العصبية إلى كل من الآبار العلوية والسفلية اليمنى ، ثم أضف 150 ميكرولتر من الوسائط إلى كل بئر علوي وأسفل يسار ضع الشريحة في الدرج المرطب في حاضنة 5٪ CO2 37 °C.
- بعد 24 ساعة ، قم بإجراء تغيير الوسائط عن طريق إزالة الوسائط من الآبار. تأكد من بقاء القناة الرئيسية ممتلئة. أضف 150 ميكرولتر من الوسائط إلى كل بئر علوي ، ثم املأ الآبار السفلية.
- ضع الشريحة مرة أخرى في الحاضنة لعدد الأيام المطلوب.
ملاحظه: راقب الوسائط كل بضعة أيام للتأكد من بقائها وردية فاتحة. إذا كانت الوسائط صفراء ، فاستبدل 50٪ منها بوسائط جديدة. إذا كان مستوى السائل منخفضا ، فتأكد من الرطوبة الكافية والاحتواء الثانوي المناسب للرقائق لمنع التبخر. يمكن تقليل أو التخلص من تغييرات الوسائط باستخدام الاحتواء الثانوي و / أو تغطية الطبق الذي يحتوي على الرقاقة بغشاء بولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) -FEP.
