زراعة الخلايا العصبية العقدية الحلزونية الفئران على مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية

الملخص

المصدر: Hahnewald، S.، et al ثقافة نبات الخلايا العصبية العقدية الحلزونية والفيزيولوجيا الكهربية على مصفوفات الأقطاب الكهربائية. J . Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو عملية عزل العقدة الحلزونية من الأذن الداخلية وزراعتها المشتركة مع عضو Corti على مجموعة متعددة الأقطاب الكهربائية. يتم استخراج العقد الحلزونية بعناية وتقسيمها إلى أقسام أنسجة أصغر أو مستعصات. يتم استزراع هذه المخططات في المنطقة النشطة لمصفوفة الأقطاب الكهربائية المتعددة لتعزيز نمو العملية العصبية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. إعداد حلول للتجارب

1. قم بإعداد محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية (ECM) (انظر جدول المواد): قم بإذابة مزيج ECM على الثلج. قم بتخفيف مزيج ECM بنسبة 1:10 في وسط المزرعة الأساسي (بدون عوامل التغذية العصبية أو مصل الأبقار الجنينية (FBS)) وتخزينه على الثلج.
2. تحضير وسط الثقافة (انظر جدول المواد): قم بإعداد مخزون من الوسط العصبي القاعدي الذي لا يحتوي على FBS أو عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF). استكمل الوسائط العصبية القاعدية ب FBS الطازج (10٪) و BDNF (5 نانوغرام / مل) قبل إضافتها إلى مزرعة الخلية.
3. تحضير المحلول خارج الخلية (انظر جدول المواد).

< p class = "jove_title" >2. غسل وتعقيم MEAs

ملاحظة: تحتوي المجالات المتوسطية المتعددة الأطراف المستخدمة في التجارب على 68 قطبا كهربائيا مرتبة في شبكة مستطيلة (الشكل 1E). يبلغ حجم كل قطب كهربائي 40 × 40 ميكرومتر^مربع مع تباعد 200 ميكرومتر من المركز إلى المركز. الأقطاب الكهربائية مصنوعة من البلاتين. يتم توصيل الأقطاب الكهربائية بجهات الاتصال المقابلة بواسطة دائرة مصنوعة من أكسيد قصدير الإنديوم. هذه الدائرة معزولة بطبقة 5 ميكرومتر من SU-8. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الموفر. قد تكون تخطيطات MEA الأخرى مناسبة لهذه التجارب.

1. بالنسبة للدول المتوسطية الجديدة: اشطفها عن طريق غمرها في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية وغسلها بالماء المقطر لمدة 30 ثانية.
2. دع MEA يجف لمدة 30 دقيقة في غطاء التدفق الرقائقي.
3. ضع كل MEA في طبق بتري معقم فردي (35 مم × 10 مم) وأغلقه بورق الألمنيوم. يمكن تخزين الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف حتى يتم استخدامها.
4. بالنسبة للمناطق المتعددة الأطراف المستخدمة: احتضان الاتفاقات البيئية في طبق بتري (35 مم × 10 مم) يحتوي على 1 مل من المحلول الأنزيمي (انظر جدول المواد) O / N على شاكر مداري في RT لإزالة المواد البيولوجية. ثم تابع كما في الخطوة 2.1.
   ملاحظه: تعامل مع MEAs بعناية باستخدام ملقط بأطراف مغطاة بالمطاط.

3. إعداد MEAs للتجارب الثقافية

1. قم بإزالة ورق التسرب واترك MEA في طبق بتري (35 مم × 10 مم) للتجربة بأكملها.
2. قم بتغطية المحطات المتعددة الأطراف بالمحلول المحضر في 1.1: استخدم طرف ماصة بارد سعة 200 ميكرولتر (مخزن عند -20 درجة مئوية) لسحب 50 ميكرولتر من محلول الطلاء لكل MEA، يغطي منطقة القطب الكهربائي بالكامل.
3. اسمح للدول المتعددة الأطراف بالتغليف لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة في RT.
4. قم بإزالة محلول الطلاء باستخدام ماصة. ضع 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع المكملة ب 10٪ FBS و 5ng / ml BDNF واتركه في RT حتى طلاء الأنسجة.
5. ضع 2 من أطباق بتري التي تحتوي على MEAs المطلية في طبق بتري كبير (94 مم × 16 مم) وأضف طبق بتري صغير ثالث يحتوي على 1.5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) للترطيب.
   ملاحظه: تعد إضافة طبق بتري صغير (الخطوة 3.5) يحتوي على PBS أمرا بالغ الأهمية لتقليل تبخر وسط الثقافة بشكل كبير.

< p class = "jove_title" >4. تشريح العقدة الحلزونية

ملاحظة: يمكن إجراء التشريح الإجمالي خارج غطاء التدفق الصفحي (الخطوة 4.1 إلى 4.4). بالنسبة للتشريح الدقيق ، تكون الظروف المعقمة (غطاء التدفق الصفحي) إلزامية (من الخطوة 4.5).

1. القتل الرحيم للحيوانات (الفئران البالغة من العمر 5-7 أيام) عن طريق قطع الرأس دون تخدير مسبق.
2. عقم الرأس بالرش بنسبة 70٪ إيثانول.
3. من خلال الإمساك بالرأس ، قم بقطع الاتصال بين الجلد والجمجمة بمقص حاد / حاد على طول الخط السهمي.
4. قطع الجمجمة سهمي وإزالة الدماغ باستخدام مقص حاد / حاد.
5. اقطع العظام الصدغية من الجمجمة وضعها في طبق بتري يحتوي على محلول الملح المتوازن هانكس المثلج المعقم (HBSS).
6. باستخدام مجهر تشريح ، قم بتشريح الفقاعات الطبلية باستخدام ملقط دقيق وعزل الأذن الداخلية.
7. قم بإزالة عظم القوقعة باستخدام ملقط ناعم.
8. قم بإزالة الرباط الحلزوني والمخطط الوعائي (SV) معا عن طريق تثبيت الجزء القاعدي من العقدة الحلزونية (SG) و SV بالملقط وفك SV ببطء من القاعدة إلى القمة
9. اعزل عضو كورتي (OC) و SG و modiolus (الشكل 1A-C).
10. افصل OC عن SG و modiolus عن طريق الإمساك بالملقط بالجزء القاعدي من SG و OC وفك OC ببطء من القاعدة إلى القمة.
11. قطع الفروع الجانبية (قطرها 200 إلى 500 ميكرومتر) من العقدة الحلزونية التي لا تزال متصلة ب modiolus (الشكل 1D) باستخدام ملقط ومشرط صغير.

5. ثقافة العقد الحلزونية على MEAs

1. ضع نبتتين عقديتين حلزونية بجوار الأقطاب الكهربائية في MEA المعدة مسبقا ب 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع.
2. ضع عضو كورتي على بعد حوالي 5 مم من منطقة القطب.
3. استخدم الملقط لتثبيت النباتات الخارجية وعضو كورتي على MEA مع تجنب إتلاف الأنسجة.
4. ضع المتوسطات البيئية بعناية في الحاضنة والثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. في اليوم التالي ، افحص بصريا أن النباتات الخارجية قد تم ربطها ب MEA.
   ملاحظه: إذا لم يتم إرفاق النباتات الخارجية ب O / N ، نادرا ما يفعلون ذلك خلال الأيام القليلة المقبلة. يتم وضع OC بجوار المزرعة للحصول على الدعم الغذائي / التغذية العصبية.
5. أضف 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الذي يحتوي على 10٪ FBS و BDNF يوميا لمدة 5 أيام متتالية.
6. في اليوم 6 ، أضف 2 مل من وسط المزرعة الذي يحتوي على 10٪ FBS و 5 نانوغرام / مل BDNF وزرع الأنسجة لمدة 13 يوما إضافية.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تحضير زراعة الخلايا. (أ) الأذن الداخلية للفأر التي تم تشريحها حديثا. يشير الخط الأبيض المتقطع إلى موقع القوقعة ، ويشير الخط الأسود المتقطع إلى المنطقة الدهليزية. (ب) الأذن الداخلية للفأر بعد إزالة الجدار العظمي للقوقعة. يشار إلى المنعطفات القوقعة بخطوط بيضاء متقطعة. (ج) تظهر العقدة الحلزونية (SG) و modiolus وعضو Corti (OC) والأوعية الدموية (SV) والرباط الحلزوني بعد التشريح. (د) تخ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الوسط العصبي القاعدي إنفيتروجين هاتف: 21103-049 24 مل (25 مل) هيبس إنفيتروجين هاتف: 15630-080 250 ميكرولتر (لكل 25 مل) جلوتاماكس إنفيتروجين 35050-061 250 ميكرولتر (لكل 25 مل) ب 27 إنفيتروجين 17504-044 500 ميكرولتر (لكل 25 مل) FBS جيبكو 10099-141 10٪ (25 مل) BDNF أنظمة البحث والتطوير 248-دينار بحريني -025 / سي ف نهائي 5 نانوغرام / مل (25 مل) كلوريد الصوديوم 145 مللي متر كيه سي إل 4 مللي متر مغنكلوريد₂ 1 مللي متر كلوريد_{الهواء 2} 2 مللي هيبس 5 مللي متر Na-pyruvate 2 مللي الجلوكوز 5 مللي متر برنامج تلفزيوني إنفيتروجين 10010023 جيش صرب البوسنه سيغما أ 4503-50 جرام 2٪ تريتون X-100 سيغما X100 0.01٪ صحن بتري 35 مم هوبرلاب 7.627 102 صحن بتري 94 مم هوبرلاب 7.633 180 دومون # 5 ملاقط WPI 14098 دومون # 55 ملاقط WPI 14099 الحل الأنزيمي: Terg-a-Zyme سيغما Z273287-11 كجم مزيج المصفوفة خارج الخلية (ECM): Matrigel TM كورنينج 356230 أقطاب MEA قواني للعلوم البيولوجية (لوزان، سويسرا)