إعادة برمجة الخلايا العصبية المباشرة للخلايا النجمية للفأر إلى الخلايا العصبية

الملخص

المصدر: Hersbach، B. A. et al. ، العزل وإعادة البرمجة العصبية المباشرة للخلايا النجمية للفأر. J. Vis. Exp. (2022)

يعرض هذا الفيديو إعادة البرمجة المباشرة للخلايا النجمية التي تعبر عن عوامل التحول إلى خلايا عصبية. تؤدي عوامل التحول إلى سلسلة من الأحداث الجزيئية التي تسهل تحويل الخلايا النجمية إلى الخلايا العصبية. يتم دعم العملية أيضا من خلال توفير عوامل ومكملات محددة من خلال وسيط التمايز العصبي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. بذر الخلايا النجمية لإعادة البرمجة

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية تحت خزانة السلامة البيولوجية بمستوى أمان 1 (SL1).

1. قم بإعداد ألواح 24 بئرا بأغطية زجاجية مطلية ب poly-D-lysine بنفس الطريقة التي تم بها تحضير قوارير الاستزراع سابقا. لتحديد عدد الألواح المطلوبة ، ضع في اعتبارك أن الخلايا النجمية مطلية بكثافة 5-5.5 × 10⁴ خلايا لكل بئر في صفيحة 24 بئرا. عادة ما ينتج عن عزل ستة حبال شوكية من فئران اليوم 2 (P2) بعد الولادة حوالي 1 × 10⁶ خلايا.
2. استنشق الوسائط من قوارير ثقافة T25 التي تحتوي على الخلايا النجمية المستزرعة واغسلها مرة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS). افصل الخلايا النجمية عن قارورة الاستزراع بإضافة 0.5 مل من 0.05٪ من حمض التربسين / الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. اضغط برفق على جانب القارورة لتحرير الخلايا من سطح قارورة المزرعة وتحقق من الانفصال تحت مجهر المجال الساطع باستخدام تكبير 10X.
3. أوقف التربسين باستخدام 2.5 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية واجمع تعليق الخلية في أنابيب سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وسحب الطاف ، وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية. احسب تركيز الخلية باستخدام مقياس الدم أو نظام عد الخلايا الآلي.
4. بناء على عدد الخلايا ، قم بتخفيف تعليق الخلية بوسط الخلايا النجمية الطازجة للحصول على محلول 1-1.1 × 105 خلية لكل مل. استكمل الوسط بعامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) بمعدل 10 نانوغرام / مل لكل عامل. أضف 500 ميكرولتر من تعليق الخلية ، أي ما يعادل 5-5.5 × 10⁴ خلايا ، إلى كل بئر من الألواح المكونة من 24 بئرا المعدة مسبقا وخلايا المزرعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.

2. التعبير القسري عن عوامل النسخ

ملاحظة: قبل متابعة البروتوكول ، من الضروري تصميم التجربة بشكل صحيح. على وجه الخصوص ، من المهم دائما تضمين عنصر تحكم سلبي لإعادة البرمجة ، أي حالة لا يتم فيها التعبير عن عامل إعادة البرمجة. على سبيل المثال ، عند استخدام المتجهات التي تحمل (كدنا) لعامل إعادة البرمجة والمراسل (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، DsRed) ، يتم تمثيل عنصر التحكم السلبي بنفس المتجه الذي يحمل المراسل فقط. عند التعبير عن عوامل متعددة تحمل مراسلين مختلفين ، يجب تعديل التحكم السلبي وفقا لذلك.

1. في اليوم التالي للطلاء ، افحص الألواح المكونة من 24 بئرا للتأكد من أن الخلايا قد تلتصقت بالغطاء.
2. بناء على الهدف التجريبي والموارد المتاحة ، يمكن تحقيق التعبير القسري عن عوامل إعادة البرمجة عن طريق نقل الفيروس (انظر الخطوة 2.3) أو تعداء الحمض النووي (انظر الخطوة 2.4).
   ملاحظة: يتطلب استخدام الفيروس القهقري أو الفيروس العدسي موافقة السلطات الحكومية ويجب إجراؤه تحت خزانة السلامة البيولوجية داخل مختبر بمستوى الأمان 2 (SL2).
3. أعد برمجة الخلايا النجمية عن طريق تحويل الخلايا باستخدام الفيروس القهقري أو الفيروس العدسي الذي يحمل المعلومات الجينية للتعبير عن عامل (عوامل) إعادة البرمجة ذات الأهمية كما هو موضح أدناه.
   1. قم بتحويل الخلايا ذات عيار الفيروس العالي 1 × 10^10-1 × 10¹² جسيم / مل عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من معلق الخلية مباشرة إلى وسط الخلايا النجمية. هذا يضمن ارتفاع معدل الإصابة. استزراع الخلايا بوسط الخلايا النجمية الذي يحتوي على جزيئات فيروسية عند 37 درجة مئوية لمدة 24-36 ساعة قبل متابعة القسم 3 ، اعتمادا على الغرض من التجربة.
      ملاحظة: يمكن استخدام محفزات مختلفة لدفع التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا (انظر أيضا النتائج التمثيلية). المحفزات التأسيسية {على سبيل المثال ، الفيروس المضخم للخلايا (CMV) ، β أكتين الدجاج (CAG)} تحفز التعبير عن الجين المعدل في وقت أبكر من المحفزات المحفزة. ومع ذلك ، فقد تم استخدام كلا النوعين من أنواع المحفزات بنجاح لإعادة برمجة الخلايا إلى خلايا عصبية.
4. يمكن أيضا إدخال بلازميدات الحمض النووي في الخلايا النجمية عن طريق تعداء الحمض النووي كما هو موضح أدناه.
   ملاحظه: يمكن القيام بذلك بموجب خزانة السلامة البيولوجية المعتمدة ل SL1.
   1. قبل التعدي ، احصل على كاشف التعدي ، والحمض النووي البلازميدي للتركيبات المرغوبة ، ووسط الخلايا النجمية الطازجة ، والوسط المخفض بالمصل (انظر جدول المواد). احسب الكمية المطلوبة من الوسط المخفض بالمصل (انظر جدول المواد) من خلال الأخذ في الاعتبار أن كل بئر من صفيحة 24 بئرا تتطلب 300 ميكرولتر من الوسط المخفض بالمصل. أضف الكمية المناسبة من الوسط المخفض بالمصل إلى أنبوب 50 مل وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية.
   2. عندما يكون الوسط المخفض دافئا ، قم بشفط وسط الخلايا النجمية من جميع الآبار واجمعه في أنبوب سعة 50 مل. قم بتصفية وسط الخلايا النجمية المجمعة باستخدام مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر لإزالة الخلايا المنفصلة.
   3. أضف حجما متساويا من وسط الخلايا النجمية الطازجة إلى الوسط المصفى للحصول على محلول كاف لإضافة 1 مل من وسط الخلايا النجمية لكل بئر. حافظ على الوسط المكيف للخلايا النجمية في الحاضنة عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام (الخطوة 2.4.9).
      ملاحظه: يتم إعادة استخدام وسط الثقافة لأنه يحتوي على العديد من العوامل المفرزة التي تدعم صلاحية الثقافة.
   4. أضف 300 ميكرولتر من وسط المصل المسخن مسبقا إلى كل بئر وضع اللوحة المكونة من 24 بئرا مرة أخرى إلى الحاضنة.
   5. تحضير المحلول أ ، الذي يتكون من الحمض النووي ووسط المصل. لكل بئر ، استخدم ما مجموعه 0.6 ميكروغرام من الحمض النووي وأضفه إلى 50 ميكرولتر من وسط المصل. قم بتخزين المحلول A في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
      ملاحظة: عادة ما يتم النظر في ثلاث نسخ فنية لكل شرط. لذلك ، يتم تحضير مزيج كاف لتفاعل 3.5 (على سبيل المثال ، 2.1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي المخفف في 175 ميكرولتر من الوسط المخفض بالمصل) لضمان مادة كافية لنقل ثلاثة آبار من صفيحة 24 بئرا.
   6. تحضير المحلول B ، المكون من كاشف التعدي والوسط المخفض بالمصل. لكل بئر ، أضف 0.75 ميكرولتر من كاشف التعداء إلى 50 ميكرولتر من الوسط المخفض بالمصل. نظرا لأن هذا الحل شائع في جميع ظروف التعدي ، فقم بإعداده بكميات كبيرة لتقليل التباين عبر التعدادات.
   7. احتضان المحلول B في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. أضف المحلول B إلى المحلول A قطرة قطرة بنسبة 1: 1 واخلطه برفق. لا تدوام. احتضان المحلول A + B لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت الغطاء.
   8. كرر الخطوة 2.4.5-2.4.7 لجميع ظروف التعداد. بعد 20-30 دقيقة ، أضف المحلول A + B إلى كل بئر قطرة قطرة للحصول على حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر.
   9. بعد 4 ساعات ، قم بإزالة وسط التعداء وأضف 1 مل من الوسط المكيف للخلايا النجمية المسخن مسبقا والمحضر في الخطوة 2.4.3. احتفظ بالخلايا لمدة 36-48 ساعة قبل متابعة القسم 3 ، اعتمادا على الغرض من التجربة.

< p class = "jove_title" >3. إعادة برمجة الخلايا النجمية (تحليل 7 أيام)

1. قم بإعداد وسيط التمايز العصبي عن طريق إضافة 1 مل من مكمل B27 إلى 49 مل من وسط الثقافة الأساسي. بعد 24-48 ساعة ، اعتمادا على ما إذا كانت الخلايا قد تم نقلها أو نقلها (انظر الخطوتين 2.3 و 2.4 ، على التوالي) ، استبدل وسط الخلايا النجمية ب 1 مل من وسط التمايز العصبي لكل بئر وخلايا الزراعة عند 37 درجة مئوية و 9٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظة: يمكن أيضا الاحتفاظ بالخلايا عند 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} إذا لم تتوفر حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 9٪. ومع ذلك ، فإن إعادة برمجة الخلايا العصبية تكون أكثر كفاءة في ظل هذه الظروف.
2. اختياري: لزيادة كفاءة إعادة البرمجة, تكملة وسيط التمايز العصبي مع فورسكولين (التركيز النهائي من 30 ميكرومتر) ودورسومورفين (التركيز النهائي من 1 ميكرومتر) عند استبدال وسط الخلايا النجمية إلى وسط التمايز. عند اختيار علاج الخلايا مع فورسكولين ودورسومورفين, توفير جرعة ثانية من دورسومورفين 2 أيام بعد العلاج الأولي. أضف هذا العلاج الثاني مباشرة إلى وسط الاستزراع.
عادة
3. ما تحدث إعادة البرمجة المباشرة للخلايا النجمية الفئران في الخلايا العصبية في غضون 7 أيام بعد تغيير الوسط (الشكل 1). ومن ثم ، بعد 7 أيام من بدء إعادة برمجة الخلايا العصبية ، قم بإصلاح الخلايا أو جمعها لتحليلها في اتجاه المصب.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: نظرة عامة على ثقافة الخلايا النجمية وإعادة البرمجة. (أ)الجدول الزمني للتحويل المباشر من الخلايا النجمية إلى الخلايا العصبية. يمثل كل خط أسود خطوة مهمة في البروتوكول. (ب) صور ممثلة للحقول الساطعة للخلايا النجمية المستمدة من الحبل الشوكي بعد 7 أيام في المزرعة. تم التقاط الصور باستخدام مجهر المجال الساطع وهدف 10x. يمثل شريط المقياس 100 ميكرومتر. (ج) صور الحقل الساطع التمثيلية للخلايا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.05٪ تريبسين / EDTA تقنيات الحياة 25300054 مكمل B27 تقنيات الحياة 17504044 bFGF تقنيات الحياة 13256029 DMEM / F12 تقنيات الحياة 21331020 دورسومورفين سيجما ألدريتش ص 5499 EGF تقنيات الحياة PHG0311 مصل الأبقار الجنينية PAN Biotech ص 30-3302 فورسكولين سيجما ألدريتش F6886 ليبوفيكتامين 2000 (كاشف النعود) ثيرمو فيشر القط # 11668019 OptiMEM - GlutaMAX (وسط مخفض) ثيرمو فيشر قطة # 51985-026 البنسلين / الستربتومايسين تقنيات الحياة 15140122 بولي د-يسين سيجما ألدريتش ص 1149