مقالة منهجية

تحضير شرائح الدماغ الإسفيني لتصور الخلايا العصبية السمعية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Fischl ، M. J. et al. ، تحضير شريحة إسفين في المختبر لتقليد اتصال الدائرة العصبية في الجسم الحي.J. Vis. Exp.(2020)

< p class = "jove_content" >يوضح هذا الفيديو عملية تحضير شرائح الدماغ على شكل إسفين في بيئة معملية. باستخدام الاهتزاز ، يتم صنع شريحة على شكل إسفين من دماغ الفأر بسماكة متفاوتة. تحتوي هذه الشريحة على جذر العصب السمعي الموجود في الطرف السميك ، بينما توجد الخلايا العصبية المرتبطة بالسمع في الطرف الرقيق.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< ص الفئة = "jove_title" >1. إزالة الدماغ مع جذر العصب السمعي السليم للتحفيز

ملاحظة: تم الحصول على الفئران لهذه التجارب عن طريق عبور الفئران المعدلة وراثيا ChAT-IRES-Cre على خلفية C57BL / 6J مع فئران tdTomato المراسلة (Ai14). كانت الفئران المستخدمة في علم الأنسجة والفيزيولوجيا الكهربية بداية ما بعد السمع (P14-P23) ، وهو حوالي P12 في الفئران. الخلايا العصبية التي تعبر عن tdالطماطم في النواة البطنية للجسم شبه المنحرف (VNTB) تم تمييزها سابقا على أنها خلايا عصبية قليلة القوقعة الإنسية (MOC) في خط الفأر هذا.

  1. القتل الرحيم (على سبيل المثال ، خنق ثاني أكسيد الكربون2) وقطع رأس باستخدام الإجراءات المؤسسية المعتمدة.
  2. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بقص الجلد عند خط الوسط للجمجمة من الأنف إلى مؤخرة الرقبة. قشر الجلد لكشف الجمجمة.
  3. باستخدام مقص صغير ، قم بعمل شق في الجمجمة عبر خط الوسط ، بدءا من القاعدة (النهاية الذيلية بالقرب من النخاع الشوكي) للجمجمة واستمر نحو الأنف.
  4. في خياطة لامدا ، قم بعمل جروح في الجمجمة من خط الوسط ، جانبيا باتجاه الأذن على كلا الجانبين. قشر الجمجمة لكشف الدماغ.
  5. بدءا من الطرف المنقاري ، ارفع الدماغ برفق بعيدا عن الجمجمة باستخدام ملعقة مختبر صغيرة أو ملقط حاد. اقطع العصب البصري واستمر في عمل الدماغ برفق للخلف ، مما يؤدي إلى تعريض السطح البطني.
  6. اقطع الأعصاب ثلاثية التوائم عن طريق قرصها بملقط رفيع بالقرب من السطح البطني لجذع الدماغ. < / > ملاحظه: افعل ذلك بعناية ، حيث يقع العصب الدهليزي القوقعي أسفل هذا مباشرة ويجب أن يكون سليما للتحفيز النهائي.
  7. ضع المستحضر في طبق بتري زجاجي مملوء بمحلول التقطيع البارد. ضع الطبق تحت مجهر تشريح. فقاعات برفق مع الكربوجين.
  8. تقليم العصب الوجهي بالقرب من جذع الدماغ وكشف العصب الدهليزي القوقعي.
  9. باستخدام ملقط ناعم ، ادفع الأطراف إلى الثقب حيث يخرج العصب الدهليزي القوقعي من الجمجمة قدر الإمكان واضغط على العصب لقطعه ، تاركا جذر العصب متصلا بجذع الدماغ. كرر هذا على الجانب الآخر.
  10. بمجرد أن يصبح كلا الجذرين العصبيين حرين ، قم بإزالة السحايا والأوعية الدموية من السطح البطني لجذع الدماغ بالقرب من الجسم شبه المنحرف.
  11. حرر الدماغ تماما من الجمجمة عن طريق الضغط على الأعصاب القحفية والأنسجة الضامة المتبقية مع الحرص على الحفاظ على الحبل الشوكي المتبقي إن أمكن.
< p class = "jove_title" >2. حظر وتركيب الدماغ على خشبة المسرح (قرص مغناطيسي)

  1. جهز سطح الدماغ لتثبيته على المسرح عن طريق منع الدماغ على مستوى التصلب البصري.
    1. مع رفع السطح البطني ، قم بتثبيت الدماغ باستخدام أداة حادة لشل حركة الحبل الشوكي برفق حتى لا يميل الدماغ خلال الخطوة التالية.
    2. على مستوى التصلب البصري ، استخدم ملقطا مفتوحا لإنشاء مستوى لسد الدماغ عن طريق إدخاله عبر الدماغ إلى أسفل الطبق. أدخل الملقط بزاوية حوالي 20 درجة من الرأسي بحيث تخرج الأطراف من السطح الظهري للدماغ الذيلية إلى التصلب البصري.
    3. قطع على طول الملقط باستخدام شفرة الحلاقة.
  2. الغراء الدماغ على سطح المرحلة.
    1. قم بإعداد كتلة صغيرة (~ 1 سم3) من أجار 4٪ لدعم الدماغ.
    2. ضع قطرة صغيرة من الغراء على المسرح وانشرها على شكل مستطيل حتى يمكن لصق كل من كتلة الدماغ والأجار.
    3. باستخدام الملقط ، ارفع الدماغ بحذر وامسح السائل الزائد برفق باستخدام حافة منشفة ورقية. ضع السطح المسدود على الغراء ، وسيكون السطح البطني باتجاه الشفرة أثناء التقطيع.
    4. ادفع كتلة الأجار برفق على السطح الظهري للدماغ لدعمها أثناء التقطيع ولضمان وضع الدماغ بشكل صحيح (أي الزاوية).
< p class = "jove_title" >3. شريحة الدماغ لإنشاء شريحة إسفين

ملاحظة: قم بإعداد شريحة دماغية باستخدام اهتزاز يحتوي على جذر العصب القوقعي على الجانب السميك والخلايا العصبية قليلة القوقعة الإنسية (MOC) والنواة الإنسية للجسم شبه المنحرف (MNTB) على الجانب الرفيع.

  1. ضع القرص المغناطيسي مع الدماغ المرفق على قاعدة المسرح وضعه في غرفة التقطيع مع توجيه السطح البطني للدماغ نحو الشفرة.
  2. املأ الغرفة بمحلول التقطيع المثلج البارد وفقاعات بالكربوجين.
  3. اخفض الشفرة في المحلول وقطع الشرائح الذيلية إلى المنطقة ذات الاهتمام للتأكد من أن الشرائح متماثلة. إذا بدت الشرائح غير متماثلة ، فقم بإمالة المسرح قليلا للحصول على التماثل. < / > ملاحظه: كانت سرعات الشفرة بين 0.05-0.10 مم / ثانية فعالة في قطع الشرائح الصحية وقد تختلف حسب عمر ومنطقة الدماغ.
  4. بمجرد أن تصبح الشرائح متناظرة ، قم بتحويل المرحلة ~ 15 درجة (المقابلة لحوالي 3 حلقات متحدة المركز على قاعدة المسرح) إلى جانب واحد. < / > ملاحظه: انقل المرحلة بعيدا عن جذر العصب السمعي الذي تريد الحفاظ عليه في الشريحة.
  5. استمر في التقطيع بعناية حتى يقترب جذر العصب السمعي من السطح على جانب واحد ، ويمكن رؤية العصب الوجهي على سطح الجانب الآخر.
  6. قم بتحويل المسرح إلى الخلف 15 درجة إلى الموضع الأصلي.
  7. حرك الشفرة بعيدا عن الأنسجة وقم بتدوير قاعدة المرحلة بزاوية 90 درجة بحيث تكون الحافة الجانبية للجانب الرفيع تواجه الشفرة. اخفض الشفرة عدة مئات من الميكرونات ثم اقترب الشفرة ببطء من حافة الأنسجة. كرر هذا حتى تلامس الشفرة الحافة الجانبية. اخفض الشفرة إلى السماكة المطلوبة للحافة الرفيعة للشريحة ، وهنا مائتي ميكرون إضافية.
    ملاحظه: من الناحية المثالية ، يبلغ سمك الشريحة الناتجة ~ 300 مم على مستوى النواة البطنية للجسم شبه المنحرف (VNTB) على الجانب الذي سيحدث فيه تثبيت التصحيح.
  8. حرك الشفرة بعيدا عن الأنسجة وقم بتدوير قاعدة المرحلة للخلف بحيث يكون السطح البطني في مواجهتها.
  9. قم بعمل القطع الذي يحدد السطح المنقاري لشريحة الإسفين. انقل الشريحة إلى قطعة من ورق الواجهة (1 سم2) السطح الذيلي لأسفل. انقل الشريحة إلى غرفة الحضانة أو أي جهاز حضانة آخر مناسب للاسترداد (30 دقيقة عند 35 درجة مئوية).
    ملاحظه: يجب أن يكون العصب الوجهي مرئيا على نصفي الكرة الأرضية من الشريحة على السطح المنقاري (انظر الشكل 1 ب).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: صورة تخطيطية لشريحة إسفين ومثال. (أ) تخطيطي لدائرة التغذية الراجعة القوقعية الداخلية. تشير الأسهم الزرقاء إلى المسار التصاعدي الوارد إلى الخلايا العصبية MOC ، وتشير الأسهم السوداء إلى مسار التغذية الراجعة التنازلي من الخلايا العصبية MOC إلى قاعدة خلايا الشعر الخارجية (OHC). (ب) صورة ساحقة لشريحة إسفين مع ملصقات لجذر العصب السمعي (ANR) ونواة القوقع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الاستعدادات التجريبية أجار ، مسحوق فيشر ساينتيك BP1423500 كتلة أجار 4٪ تستخدم لتثبيت أنسجة المخ أثناء التقطيع الاهتزازي أليكسا فلور هيدرازيد 488 إنفيتروجين أ10436 يستخدم الفلوروفور في المحلول الداخلي لتأكيد نجاح رقعة الخلايا العصبية MOC الميزان التحليلي الجينات العلمية (Intramalls) أيه في 114 كيماويات الوزن شفرة حلاقة ذات حدين تيد بيلا 121-6 شفرة قطع الاهتزاز حمض الكينورينيك (5 جم) سيجما ألدريتش كيه 3375-5 جي تستخدم مادة مضافة ACSF للتقطيع لتقليل نشاط الخلايا العصبية أثناء التشريح والتقطيع من أجل تحسين صحة الأنسجة لقط التصحيح مقياس الأس الهيدروجيني فيشر ساينتفيك (إنترامولز) 13-620-451 اختبار درجة الحموضة بالمحلول أطباق بتري بلاستيكية 100 مم قطر × 20 مم فيشر ساينتفيك (إنترامولز) 12-556-002 4٪ أجار الإعدادية تحريك لوح التسخين فيشر ساينتفيك (إنترامولز) 11-500-150 تسخين لتحضير أجار بنسبة 4٪ التشريح والتقطيع بيوسيتين سيجما ألدريتش B4261-250 ملغ مادة كيميائية تستخدم في التتبع المحوري (مقترنة بالستربتافيدين 488) تشريح المجهر أمسكوب SM-1BN للتشريح الدقيق أثناء إزالة الدماغ دومون # 5 ملقط أدوات العلوم الدقيقة 11252-20 أداة تشريح الملقط الدقيق ملاقط اقتصادية # 3 WPI 501976 أداة تشريح الملقط طبق بتري زجاجي 150 مم قطر × 15 مم ارتفاع فيشر ساينتفيك (إنترامولز) 08-747ه طبق تشريح ورق الواجهة (غشاء PCTE مقاس 203 × 254 مم 10 ميكرومتر) توماس العلمية 1220823 حضانة الشريحة / تطبيق biocytin لايكا VT1200S Vibratome لايكا هاتف: 1491200S001 الاهتزاز لتقسيم شرائح الوتد مقص Mayo روبوز RS-6872 أداة التشريح شفرات أحادية الحدة من الصلب الكربوني فيشر ساينتفيك (إنترامولز) 12-640 شفرة الحلاقة للتشريح قرص العينة ، التوجيه لايكا 14048142068 مرحلة الاهتزاز المتخصصة للإمالة القابلة للتكرار ملعقة فيشرسي 14-375-10 أداة التشريح سوبر غراء نيوإيج 15187 [م] تستخدم للصق الأنسجة على مرحلة الاهتزاز مقص الربيع Vannas أدوات العلوم الدقيقة 91500-09 أداة التشريح

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة