مقالة منهجية

تحفيز تمايز الخلايا العصبية باستخدام قضبان الذهب النانوية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Paviolo., et al. التحفيز البصري بمساعدة النانو الذهبي للخلايا العصبية. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو تقنية لتعزيز التمايز العصبي عن طريق تعريض الخلايا العصبية لقضبان نانوية ذهبية وضوء الليزر ، والذي يشكل إسقاطات خلوية مدعومة ب βIII-tubulin. يكشف تلطيخ ومراقبة التوبولين ونواة الخلية باستخدام الفحص المجهري epifluorescence عن نمو الخلايا ، مما يشير إلى فعالية القضبان النانوية في التمايز العصبي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. NG108-15 ثقافة خط الخلايا العصبية والتمايز

  1. بالنسبة لوسط زراعة الخلايا ، قم بإعداد 500 مل من وسط النسر المعدل المعقم (DMEM) من Dulbecco الذي يحتوي على 10٪ (وزن / حجم) مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) ، و 1٪ (وزن / حجم) L-glutamine ، و 1٪ (وزن / حجم) البنسلين / الستربتومايسين و 0.5٪ (وزن / حجم) أمفوتريسين B.
    ملاحظة: يمكن اقتباس المكملات الغذائية وتخزينها عند -20 درجة مئوية وإضافتها إلى الوسائط في اليوم المطلوب. يمكن تبريد وسط زراعة الخلايا في حالة معقمة لمدة أقصاها شهر واحد.
  2. بالنسبة لوسط تمايز الخلايا ، قم بإعداد 50 مل من DMEM المعقم الذي يحتوي على 1٪ (وزن / حجم) L-glutamine ، و 1٪ (وزن / حجم) بنسلين / ستربتومايسين ، و 0.5٪ (وزن / حجم) أمفوتريسين B.
  3. قم بزراعة الخلايا العصبية NG108-15 في 10 مل من وسط زراعة الخلايا في قوارير T75 مصنوعة من البوليسترين في حاضنة ذات جو مرطب (5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية). عادة ، البذور 1.5-2 × 105 خلايا في كل قارورة لتكون جاهزة في غضون 3-4 أيام. قم بتغيير وسط زراعة الخلية كل يومين.
    ملاحظة: لمنع الانجرافات الجينية أو التباين ، لا تستخدم الخلايا الأقدم من الممر 21 للتجارب.
  4. عندما يلتقي 70-80٪ في الثقافة ، قم بتغيير الوسط بوسط زراعة الخلايا الطازجة الدافئة. افصل الخلايا ميكانيكيا عن طريق طرق الجزء السفلي من القارورة المتقاربة برفق. لا تستخدم التربسين.
  5. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 5 دقائق عند 600 × جم وأعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من وسط تمايز الخلايا الدافئة.
  6. البذور 2 × 104 خلايا / سم2 في صفيحة بئر البوليسترين 96 لزراعة الأنسجة مع 200 ميكرولتر من وسط تمايز الخلايا. احتضان التجربة لمدة يوم واحد عند 5٪ CO2 / 37 °C.
  7. أضف ما بين 3.2 × 109 - 4.2 × 1010 جزيئات / مل من محلول الذهب النانوي (Au NR) في اليوم 2 واحتضنه لمدة 24 ساعة إضافية. لا تضيف الجسيمات لتجارب التحكم.
    ملاحظة: كعنصر تحكم بديل ، يمكن استخدام جسيمات الذهب النانوية (Au NPs) ذات الطول الموجي لامتصاص الذروة المتمايز جيدا لأغراض المقارنة ، للحصول على سلوك خلوي أكثر اتساقا ، حافظ على كثافة الخلية ثابتة ولا تعدل سطح البئر قبل تلقيح الخلية.
< ص فئة = "jove_title" >2. تعزيز نمو العصبية

  1. قم بإقران الليزر بألياف ضوئية أحادية الوضع (فتحة عددية = 0.13) وقم بإنهائها بموصل ألياف (موصلات FC مريحة ومتاحة بشكل شائع). قم بقياس طاقة الليزر الناتجة باستخدام مقياس طاقة قياسي. للحصول على النتائج الأكثر فاعلية ، قم بمطابقة ذروة الطول الموجي لليزر مع ذروة رنين البلازمون في NRs.
  2. في اليوم 3 بعد حضانة NR ، قم بإصلاح موصل FC في البئر. تشعيع العينات وأدوات التحكم في RT لمدة 1 دقيقة في موجة مستمرة لقوى ليزر مختلفة. اسمح للثقافة بالمضي قدما لمدة 3 أيام إضافية عند 5٪ CO2 / 37 °C. كرر تشعيع الليزر لمدة 3 قياسات مستقلة على الأقل.
    ملاحظة: يمكن تحديد أوقات تشعيع وترددات نبضة مختلفة حسب التطبيق.
  3. تميز الليزر من حيث قطر الشعاع وإشعاع الليزر (W∙cm-2).
    1. بالنسبة للألياف القياسية أحادية الوضع ، استخدم NA = n∙sinθ ، حيث n هو معامل الانكسار للوسط المستخدم و θ هو نصف زاوية مخروط الضوء الخارج من الألياف (انظر الشكل 1 أ). من علم المثلثات ، r = tanθ∙d ، حيث r هو نصف قطر الحزمة و d هي المسافة بين الألياف والعينة. يتطابق موصل FC مع قطر البئر ، وبالتالي يضيء العينة على مسافة d = 2.70 ± 0.20 مم. يخرج الضوء من الألياف في الماء (ن = 1.33) ، مما يعطي r = tan (sin-1 (NA / n)) ∙d.
    2. باستخدام المعادلة الأخيرة ، احسب نصف قطر شعاع الليزر ، ومساحة الشعاع المقابلة ، ومتوسط إشعاع الليزر (قوة الليزر مقسومة على منطقة الحزمة) عند الهدف (انظر الرسم البياني المثال في الشكل 1 ب). تمثل هذه القيم متوسط الإشعاع فوق المنطقة المضيئة.
    3. تقييم أخطاء القياسات باستخدام النظرية العامة لانتشار الخطأ.
      ملاحظة: يمكن قياس المسافة بين موصل FC والعينة عن طريق صور فوتوغرافية للترتيب التجريبي والمعالجة اللاحقة للصورة باستخدام البرامج المناسبة (مثل ImageJ).
  4. في اليوم 5 ، قم بإزالة وسيط تمايز الخلية من التجارب وقم بإصلاح العينات بمحلول فورمالديهايد 3.7٪ (v / v) لمدة 10 دقائق ، ثم تخلل الخلايا بنسبة 0.1٪ (v / v) Triton X-100 لمدة 20 دقيقة.
  5. أضف 3٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل الأبقار (BSA) إلى العينات لمدة 60 دقيقة لمنع مواقع ارتباط البروتين غير المتفاعلة. قم بتسمية العينات الخاصة بمضادات βIII-tubulin طوال الليل (5 ميكروغرام / مل في PBS مكملة بنسبة 1٪ من BSA) عند 4 درجات مئوية.
  6. احتضان الخلايا لمدة 90 دقيقة في الظلام بجسم مضاد ثانوي مناسب (على سبيل المثال ، TRITC (Tetramethylrhodamine) - الجسم المضاد IgG المترافق المضاد للفأر) باستخدام تركيز 0.4-2 ميكروغرام / مل في 1٪ BSA في PBS. قم بتسمية نوى الخلية ب DAPI (4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole) (0.1 ميكروغرام / مل في الماء منزوع الأيونات) لمدة 10 دقائق < br / > ملاحظة: قد يختلف اقتران الأجسام المضادة وتركيزها وفقا لبروتوكول الشركة. اغسل العينات باستخدام PBS مرتين لمدة 5 دقائق بعد كل مرحلة تلطيخ.
  7. صور عينات عن طريق التألق أو الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام هدف 20× على الأقل. اختر مرشحات المجهر وفقا للجسم المضاد الثانوي. حدد مرشح DAPI (λEX = 358 نانومتر ؛ λEM = 488 نانومتر) لتصور نوى الخلية.
  8. قم بتحليل الصور عن طريق تقييم: أنا) الحد الأقصى لطول العصبية (سجل الطول من طرف العصبية إلى بداية جسم الخلية) ، ب) عدد الخلايا العصبية لكل خلية عصبية (جمع جميع الخلايا العصبية لكل خلية) و ج) النسبة المئوية للخلايا التي تحتوي على الخلايا العصبية (اقسم العدد الإجمالي للخلايا التي تعبر عن βIII-tubulin على العدد الإجمالي للخلايا ذات النواة الملطخة إيجابيا)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1. الإعداد التجريبي للألياف الضوئية (A) ومتوسط إشعاعات الليزر كدالة لطاقة الليزر لشعاع ليزر من مساحة تساوي 0.4 مم 2 (ب). معلمات الحزمة هي (A): نصف زاوية الحد الأقصى لمخروط الضوء الخارج من الألياف (θ) ، ونصف قطر الحزمة (r) والمسافة بين الألياف الضوئية والعينة (d).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الاتحاد الافريقي NR سيجما ألدريتش 716812 إن جي 108-15 سيجما ألدريتش 8811230 DMEM سيجما ألدريتش د6546 FCS تقنيات الحياة 10100147 ل-جلوتامين سيجما ألدريتش جي 7513 البنسلين / الستربتومايسين تقنيات الحياة 15140122 الأمفوتريسين ب تقنيات الحياة 15290018 فورمالدهيد سيجما ألدريتش F8775 تريتون X-100 BDH تي 8532 جيش صرب البوسنه سيجما ألدريتش أ 2058 مضاد βIII-tubulin بروميجا جي 7121 الجسم المضاد IgG المترافق TRITC المضاد للفأر سيجما ألدريتش تي 5393 دابي إنفيتروجين د1306 مطياف الأشعة فوق البنفسجية شركة فاريان للأنظمة الطبية كاري 50 بيو جهاز طرد مركزي صغير إيبندورف تدور صغير حمام سونيك يونيسونيكس أستراليا FPX 10D حاضنة زراعة الخلايا كندرو خلية هيرا 150 جهاز الطرد المركزي لزراعة الخلايا هيتيتش روتوفيكس 32 أ الصمام الثنائي بالليزر Optotech 780 نانومتر ألياف أحادية الوضع - LD مقترنة الألياف الضوئية ثورلاب 780 حصان عداد الطاقة متماسك فحص الليزر إيمج جيه http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html مجهر epifluorescent أدوات محور إيمج إكس اضغط 5000 أمبير برنامج تلفزيوني البوليسترين 96 لوحة بئر ثاني أكسيد الكربون قوارير T75

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

3 DAPI

مقالات ذات صلة