توليد مزارع الخلايا العقدية الشبكية الأولية من أجنة الزرد

الملخص

المصدر: Terzi، A.، et al.، ROS تصوير الخلايا الحية أثناء تطور الخلايا العصبية. J. Vis. إكسب. (2021)

يوضح الفيديو طريقة لزراعة الخلايا العقدية الأولية للشبكية من أجنة الزرد. تخضع الأجنة في المرحلة المبكرة للتشريح لعزل العينين ، والتي يتم فصلها ميكانيكيا لاحقا في تعليق الخلايا العقدية الشبكية. يتم زراعة معلق الخلية هذا على أغطية مطلية ببروتينات لاصقة لتسهيل تطوير المحور العصبي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إعداد الحلول

1. وسائط E2 (1x)
   1. قم بإعداد 100x E2A (500 مل) و 500x E2B (100 مل) و 500x E2C (100 مل) من خلال الجمع بين جميع المكونات الموضحة في الجدول 1. حلول الأوتوكلاف E2A و E2B و E2C. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   2. بالنسبة لوسائط 1x E2: اجمع بين 5 مل من 100x E2A و 1 مل من 500x E2B و 1 مل من 500x E2C. ارفع الحجم إلى 500 مل بالماء المعقم. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0-7.5.
   3. قم بإعداد 50 مل من وسائط 1x E2 وتخزينها عند -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. ومع ذلك ، يمكن أن تحدث هطول الأمطار عند الذوبان. تأكد من ذوبان هطول الأمطار تماما قبل استخدام محلول المخزون.

الجدول 1: مكونات 1x E2 الوسائط لزراعة خلايا سمك الزرد.

حل مكون مبلغ تركيز 100X E2A (500 مل) كلوريد الصوديوم 43.8 جرام 1500 ملم كيه سي إل 1.88 جرام 50 ملم MgSO₄ 6 جرام 100 ملم KH₂PO₄ 1.03 جرام 15 ملي نا₂HPO₄ 0.34 جرام 5 مللي متر 500X E2B (100 مل) كلوريد_{الهواء 2} 5.5 جرام 500 ملم 500X E2C (100 مل) NaHCO₃ 3 جرام 350 ملم 1X E2 (500 مل) 100X E2A 5 مل 1 مرة 500X E2B 1 مل 1 مرة 500X E2C 1 مل 1 مرة

2. E3 Media (1x)
   1. قم بإذابة المكونات في ماء معقم سعة 1 لتر كما هو موضح في الجدول 2 لعمل مخزون 100x. خفف المرق في ماء معقم لعمل وسائط 1x E3.
   2. أضف 0.2٪ أزرق الميثيلين. للحصول على 20 مل من وسائط 1x E3 ، أضف 40 ميكرولتر من الميثيلين الأزرق.

الجدول 2: مكونات وسائط 100x E3 للحفاظ على أجنة أسماك الزرد.

مكون المبلغ (جم) التركيز في مخزون 100X (ملليمتر) كلوريد الصوديوم 29.22 [إك] 500 جنيه كيه سي إل 1.26 17 كلوريد_{الهواء 2} 2 ساعة₂س 4.85 دولار 33 MgSO₄ 7H₂O 8.13 [إك] 33

3. محلول مخزون ملحي 80x
   1. اجمع بين جميع المكونات المبينة في الجدول 3. أضف الماء لعمل محلول 100 مل. امزج حتى تذوب جميع المكونات. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

< p class = "jove_content" > الجدول 3: مكونات محلول ملحي 80x لوسائط زراعة خلايا الزرد.

مكون المبلغ (جم) التركيز في المخزون (مللي مولار) الجلوكوز 1.44 دولار أمريكي 80 بيروفات الصوديوم 0.44 40 كلوريد_{الهواء 2} 2 ساعة₂س 0.148 دولار 10 هيبس 6.1 256 ريال

4. وسط استزراع خلايا الزرد (ZFCM+)
   1. اجمع بين جميع المكونات الموضحة في الجدول 4 لعمل وسائط سعة 250 مل. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.5. قم بتصفية الوسائط باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينها عند 4 درجات مئوية.

الجدول 4: مكونات وسط استزراع خلايا الزرد مع المصل والمضادات الحيوية.

مكون المبلغ (مل) الحجم٪ L-15 متوسط (مع الفينول الأحمر) 212.75 دولار 85.1 [م] مصل الأبقار الجنينية (FBS) 5 2 البنسلين / الستربتومايسين 1 0.4 محلول ملحي 80X 3.125 [ا] 1.25 الماء 28.125 دولار 11.25

2. زراعة الخلايا العقدية الشبكية الأولية المشتقة من أجنة الزرد

ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوتين 2.1 و 2.2 في غطاء التدفق الرقائقي.

1. تحضير أغطية
   1. قم بإعداد 4-6 لوحات ثقافة في كل تجربة. استخدم أغطية نظيفة بالحمض (22 × 22 مم مربع؛ سمك 0.16-0.19 مم) يتم تخزينها في الإيثانول بنسبة 100٪.
   2. قم بإزالة غطاء واحد من حاوية التخزين باستخدام ملقط وقم بإشعاله لإزالة الإيثانول المتبقي.
   3. قم بتجفيف الغطاء تماما في الهواء عن طريق وضعه بزاوية داخل طبق ثقافة مقاس 35 مم.
   4. تحضير محلول عمل Poly-D-Lysine (PDL) (1x) عن طريق تخفيف 10x مخزون (5 مجم / مل) في ماء معقم.
   5. ضع 100 ميكرولتر من 0.5 مجم / مل PDL على وسط كل غطاء وتجنب انتشار المحلول على الحواف.
   6. احتضان PDL على أغطية لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). تأكد من عدم جفاف PDL.
   7. اغسل PDL بماء معقم 0.5 مل ثلاث مرات. دع الأطباق تجف تماما.
   8. تحضير محلول عمل اللامينين (1x) عن طريق تخفيف 50x مخزون (1 مجم / مل) في 1x PBS.
   9. ضع 100 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل من اللامينين في PBS على وسط كل غطاء وتجنب انتشار المحلول على الحواف.
   10. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة لمدة 2-6 ساعات. تجنب تجفيف محلول اللامينين.
2. تشريح الأجنة وطلاء RGCs
   1. قم بإعداد وتسمية أربعة أطباق لزراعة الأنسجة مقاس 35 مم واملأها ب 4 مل من: 70٪ إيثانول ، "E2 media 1" ، "E2 media 2" ، "E2 media 3" في يوم التشريح. احتفظ بالأطباق في الثلاجة حتى التشريح.
   2. عندما تكون أجنة الزرد بعد 34 ساعة من الإخصاب (HPF) ، أخرج أطباق الاستزراع المغلفة باللامينين من الحاضنة واغسل الغطاء ثلاث مرات باستخدام 0.5 مل من 1x PBS.
   3. بعد الغسيل النهائي ، أضف 4 مل من وسائط ZFCM (+) إلى كل طبق ثقافة وتجنب تجفيف اللوحة.
   4. استرجع أطباق الثقافة المحضرة من الخطوة 2.2.1. دعهم يوازنون مع RT.
   5. املأ 4-6 أنابيب PCR ب 15 ميكرولتر من وسائط ZFCM (+). هناك حاجة إلى أنبوب واحد لإعداد RGCs من 4 عيون ليتم طلاؤها على غطاء واحد.
   6. استرجع أجنة الزرد من الحاضنة واغمر الأجنة في طبق زراعة أنسجة 35 مم يحتوي على 70٪ إيثانول لمدة 5-10 ثوان للتعقيم.
   7. باستخدام ماصة النقل ، انقل الأجنة إلى طبق E2 Media 1 الذي يحتوي على وسائط E2 معقمة لغسل الإيثانول الزائد.
   8. انقل الأجنة إلى طبق E2 Media 2 وقم بإزالة المشيمات باستخدام ملقط حاد.
   9. انقل الأجنة إلى طبق E2 Media 3 النهائي لإجراء التشريح.
   10. باستخدام زوج من الملقط الدقيق ، قم بتشريح شبكية العين.
   11. ضع الأجنة واحتفظ بها أمام صفار البيض بأحد الملقط وقم بإزالة الذيل الخلفي لكيس الصفار باستخدام الملقط الآخر.
   12. أمسك الرقبة بالملقط وانزع الرأس لتعريض الدماغ والعينين لوسائط E2. تجنب قطع كيس الصفار.
   13. باستخدام طرف الملقط الناعم ، قم بلف العينين برفق من الرأس ، مع إمساك أنسجة الجمجمة لأسفل بالملقط الثاني. حافظ على العيون معزولة عن بقايا الأنسجة المجاورة.
   14. انقل أربع عيون إلى أحد الأنابيب المعدة مسبقا والتي تحتوي على ZFCM (+).
   15. قم بالمعايرة برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P20 وطرف أصفر حوالي 45 مرة لفصل الخلايا. تجنب أي فقاعات هواء.
   16. انقل ZFCM (+) بالخلايا المنفصلة إلى مركز الغطاء. كرر الخطوات من 10 إلى 12 للحصول على أغطية إضافية.
   17. حافظ على الثقافات على سطح الطاولة عند 22 درجة مئوية على رف رغوة البوليسترين لامتصاص الاهتزازات.
   18. إجراء التصوير بعد 6-24 ساعة من الطلاء.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات طبق ثقافة 35 مم سارستيدت 83-3900 ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم فيشر ساينتيك سي 79-500 غطاء زجاجي كورنينج 2850-22 أطباق بتري يمكن التخلص منها (100 × 15 مم) VWR هاتف: 25384-094 مصل الأبقار الجنينية ثيرموفيشر العلمي 26140087 الجلوكوز سيجما ألديتش جي 7528 هيبس سيجما ألديتش إتش 4034 لامينين ثيرموفيشر العلمي 23017-015 L-15 من Leibovitz متوسط بدون فينول أحمر جيبكو / فيشر ساینتفيك 21-083-027 برنامج تلفزيوني هيكلون / فيشر ساینتفيك SH3025601 البنسلين / الستربتومايسين ثيرموفيشر العلمي 15140122 بولي د-يسين (PDL) سيجما ألديتش P7280 بيروفات الصوديوم سيجما ألديتش ص 5280 مرشح Steritop 0.22 ميكرومتر ميليبور S2GPT05RE