توليد الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم

الملخص

المصدر: Becker-Kojić, Z. A., et al. جيل خال من الخلايا العصبية المشتقة من الدم. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو تقنية لتوليد الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs). يتم الحصول على BD-PSCs عن طريق إعادة برمجة الخلايا السلفية للدم. يتم استزراع BD-PSCs غير المتمايزة على أغطية مغلفة بالركيزة لزراعة الخلايا باستخدام وسيط تحريض عصبي ووسط تمايز عصبي ، مما يؤدي إلى التمايز إلى خلايا ذات نمط ظاهري عصبي.

البروتوكول

تم الحصول على الموافقات الأخلاقية عند إجراء التجارب.

< p class = "jove_title" >1. عزل الخلايا أحادية النواة للدم المحيطي البشري (PBMNCs)

1. ضمان توقيع جميع المتبرعين على الموافقة المستنيرة قبل سحب الدم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
2. خذ 30 مل من الدم من متبرعين أصحاء من قبل طاقم طبي مدرب وفقا للبروتوكول القياسي.
3. عزل PBMNCs بواسطة وسائط تدرج الكثافة. استخدم 10 مل من الوسائط مع 25 مل من الدم 1: 1 المخفف بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 30 دقيقة.
4. عزل طبقة الطور البيني بين البلازما ووسائط تدرج الكثافة عن طريق سحب العينات. اغسل الخلايا المعزولة ب 5 مل من PBS المعقم وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق.
5. احسب عدد الخلايا بالطرق القياسية باستخدام غرفة العد.

فئة

2. تنشيط البروتين السكري البشري المثبت على الجليكوسيل فوسفاتيديلينوسيتول (GPI) عن طريق تشابك الأجسام المضادة على سطح PBMNCs

1. ضع 6 × 10 6 خلايا أحادية النواة (MNCs) في أنابيب سعة 15 مل وقم بإجراء تشابك الأجسام المضادة عن طريق احتضان الخلايا بجسم مضاد خاص ببروتين غشاء مرتبط ب GPI (30 ميكروغرام / مل) لمدة 30 دقيقة في PBS مع 1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) عند 37 درجة مئوية.
2. استبدل وسط الحضانة بوسط Dulbecco المعدل من Iscove المكمل بمصل بقري الجنين بنسبة 10٪ (FBS).
3. قم بزراعة الخلايا في أنابيب البوليسترين سعة 15 مل ، ضع الأنابيب في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 8-10 أيام (بدون اهتزاز). في اليوم 5 (D5) ، أضف 1-2 مل إضافي من وسط Iscove مع 10٪ FBS لكل أنبوب سعة 15 مل.

< p class = "jove_title" >3. فرز الخلايا غير المتمايزة التي تم إنشاؤها حديثا

1. عد الخلايا بعداد الخلايا الآلي (معلق خلية 18 ميكرولتر + صبغة مضان 2 ميكرولتر) أو في غرفة العد.
2. معلق الخلية المزروع بأجهزة الطرد المركزي (5-7 × 10⁶) عند 300 × جم لمدة 10 دقائق وشفط المادة الطافية الناتجة بماصة باستور معقمة.
3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 90 ميكرولتر من درجة الحموضة PBS المبردة مسبقا 7.2 و 0.5٪ BSA و 2 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA).
4. أضف حبات مغناطيسية بحجم النانو CD45 موجبة (80 ميكرولتر) إلى تعليق الخلية واحتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة.
5. اغسل الخلايا بإضافة 2 مل من المخزن المؤقت PBS والطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق.
6. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS.
7. اغسل العمود ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS المبرد مسبقا وضعه في المجال المغناطيسي.
8. ضع تعليق الخلية على العمود واغسله ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS (مرتين) وتدفق أجهزة الطرد المركزي التي تحتوي على خلايا سالبة CD45. اجمعها في وسط Iscove المكمل بنسبة 1٪ BSA.
9. عد الخلايا في غرفة العد.

< p class = "jove_title" >4. تحضير أطباق زراعة الخلايا للتمايز العصبي للخلايا الجذعية المتولدة حديثا

1. قم بتغطية أوعية الثقافة ب poly-L-ornithine و laminin لزراعة الخلايا العصبية.
2. ضع الغطاء الزجاجي في ألواح ذات 4 آبار وقم بتغطيته ب 1: 5 بولي L-ornithine المخفف (0.1 مجم / مل في الماء المقطر المزدوج [ddH₂O]) في ddH₂O. ضع الغطاء في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ثم يغسل مع ddH₂O.
3. قم بإذابة اللامينين ببطء (0.5-2.0 مجم / مل) وأضفه إلى الجزء العلوي من الغطاء. احتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
4. تحضير وسط الحث العصبي N2 يتكون من 49 مل من خليط النسر المتوسط / المغذيات المعدل من Dulbecco F-12 (D-MEM / F12) ، 500 ميكرولتر من مكمل N2 ، 400 ميكرولتر من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، محلول عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (FGF) بتركيز نهائي 20 نانوغرام / مل (محضر من محلول مخزون 100 ميكروغرام / مل) ، والهيبارين بتركيز نهائي 2 نانوغرام / مل.
5. قم بإزالة اللامينين الزائد عن طريق سحب العينات وأضف الوسط العصبي N2 إلى أطباق الاستزراع.

< p class = "jove_title" >5. استزراع خلايا الدم العصبية غير المتمايزة

1. زراعة الخلايا السالبة CD45 المشتقة من BD على أغطية زجاجية مطلية بمادة اللامينين / أورنيثين لمدة يومين في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في وسط N2 لبدء التمايز العصبي للخلايا التي تم إنشاؤها حديثا بواسطة BD.
2. زراعة الخلايا في وسط التمايز العصبي يتكون من 48 مل من الوسط العصبي القاعدي ، و 500 ميكرولتر من L-glutamine ، و 1 مل من مكمل B27 ، و 500 ميكرولتر من NEAA ، و 50 ميكرولتر من عامل التغذية العصبية المشتق من الخلايا الدبقية البشرية المؤتلف (GDNF) عند 5 ميكروغرام / 250 ميكرولتر في PBS / 0.1٪ BSA ، و 50 ميكرولتر من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ البشري المؤتلف (BDNF) عند 5 ميكروغرام / 200 ميكرولتر في PBS / 0.1٪ BSA و 50 ميكرولتر من محلول حمض الأسكوربيك 2.9 جم / 50 مل في PBS. ضع الأطباق في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كسر الألبومين الخامس روث تي 8444.4 طقم صلاحية خلية AO / PI بوزيم 872045 توقف Biozym. المنتج الذي تنتجه Logos Biosystems. حمض الأسكوربيك 2-فوسفات سيكيماغنيس سيجما ألدريتش أ 8960-5 جي سيروم B27 خال من 50x فيشر ساینتيفيك (جيبكو) 11530536 الحل الأساسي ل FGF فيشر ساینتيفيك (جيبكو) 10647225 بيوكول ميرك ميليبور L6115-قبل الميلاد وسائط التدرج في الكثافة BSA Frac V 7.5٪ جيبكو 15260037 CD45 MicroBeads ميلتيني 130-045-801 حبات مغناطيسية بحجم النانو شرائح عد الخلايا لونا بوزيم 872010 توقف Biozym. المنتج الذي تنتجه Logos Biosystems. D-MEM / F12 ميرك ميليبور FG4815-BC FBS ميرك ميليبور S0115 / 1030B توقف. متاح تحت: TMS-013-B GDNF مؤتلف للإنسان فيشر ساینتيفيك (جيبكو) 10679963 جلوتا ماكس 100x جيبكو 35050038 ل-جلوتامين خلية الصوديوم الهيبارين سيجما ألدريتش H3149-50KU BDNF البشري فيشر ساینتيفيك (جيبكو) 11588836 Iscove (IMDM) بيوكروم FG0465 الفأر اللامينين فيشر ساینتيفيك (جيبكو) 10267092 Luna FL عداد الخلايا الآلي بوزيم 872040 توقف Biozym. المنتج الذي تنتجه Logos Biosystems. MACS المخزن المؤقت ميلتيني 130-091-221 ميم نيا 100x جيبكو 11140035 MiniMACS Trennsäulen ميلتيني 130-042-201 Multiplatte Nunclon 4 آبار فيشر ساينتيك 10507591 ملحق N2 100x فيشر ساینتيفيك (جيبكو) 11520536 الوسط العصبي القاعدي جيبكو 10888022 PBS معقمة روث 9143.2 بولي إل أورنيثين سيجما ألدريتش P4957-50 مل