نمو وتمايز الخلايا العصبية المحملة بجسيمات النانو المغناطيسية على المنصات المغناطيسية

الملخص

المصدر: Indech، G.، et al. تصنيع المنصات المغناطيسية لتنظيم الخلايا العصبية المترابطة على نطاق ميكرون. J. Vis. Exp. (2021).

< p class = "jove_content">يوضح هذا الفيديو امتصاص الخلايا العصبية للجسيمات النانوية المغناطيسية الفلورية (MNPs) عن طريق الالتقام الخلوي. إن زراعة هذه الخلايا العصبية المحملة ب MNP على الركيزة المزخرفة مغناطيسيا تمكن من ربط الخلايا. تساعد إضافة عامل نمو يحتوي على وسيط في نمو امتدادات الخلايا العصبية ، بينما يوجه المجال المغناطيسي للركيزة اتجاه الامتداد.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. امتصاص الجسيمات النانوية المغناطيسية الخلوية (MNP)

1. قم بإعداد وسط النمو الأساسي لزراعة خلايا PC12 عن طريق إضافة 10٪ مصل الحصان (HS) ، و 5٪ مصل بقري الجنين (FBS) ، و 1٪ L-glutamine ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 0.2٪ أمفوتريسين إلى وسط معهد روزويل بارك الطبي (RPMI) ، والترشيح باستخدام مرشح نايلون 0.22 ميكرومتر.
2. أضف 1٪ مصل الحصان (HS) ، و 1٪ L-glutamine ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 0.2٪ أمفوتريسين إلى وسط RPMI لتحضير وسيط التمايز PC12 والتصفية باستخدام مرشح نايلون 0.22 ميكرومتر.
3. قم بزراعة الخلايا في قارورة مزرعة غير معالجة مع 10 مل من وسط النمو الأساسي ؛ أضف 10 مل من وسط النمو الأساسي إلى القارورة كل 2-3 أيام ، وزرع الخلايا الفرعية بعد 8 أيام.
4. للامتصاص الخلوي ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي لمدة 8 دقائق عند 200 × جم ودرجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية.
5. أعد تعليق الخلايا في 3 مل من وسط النمو الأساسي الطازج. مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 5 دقائق عند 200 × جم ودرجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 3 مل من وسط التمايز الجديد.
6. استنشق الخلايا 10 مرات باستخدام حقنة وإبرة لتفتيت مجموعات الخلايا. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم ، وقم بزرع 10⁶ خلايا في طبق عادي غير مطلي مقاس 35 مم.
7. أضف إلى الطبق الحجم المحسوب لتعليق MNP وحجم وسط التمايز لتحقيق تركيز MNP المطلوب والحجم الإجمالي. امزج الخلايا ، MNPs ، ووسط التمايز ؛ احتضان الطبق في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
قم
8. بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 5 دقائق عند 200 × جم في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط التمايز الطازج ، وعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.

< p class = "jove_title" >2. تمايز الخلايا ونموها على المنصة المغناطيسية

1. نظف الركيزة المزخرفة بنسبة 70٪ v / v / ethanol وضع الركيزة في طبق ثقافة 35 مم في الغطاء. ضع مغناطيسا كبيرا (~ 1500 Oersted) أسفل الركيزة المزخرفة لمدة 1 دقيقة وقم بإزالة المغناطيس عن طريق تحريك الطبق أولا لأعلى وبعيدا عن المغناطيس ، ثم أخرج المغناطيس من الغطاء. قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
2. قم بتغطية الركيزة بالكولاجين من النوع 1 عن طريق تخفيف الكولاجين من النوع 1 (محلول من ذيل الفئران) 1:50 في 30٪ من الإيثانول الحجمي الخامس. لطلاء طبق 35 مم ، أضف 20 ميكرولتر من الكولاجين إلى 1 مل من الإيثانول بنسبة 30٪.
3. غطي الطبق بالمحلول ، وانتظر حتى يتبخر كل المحلول ، واترك الطبق مكشوفا لبضع ساعات. اغسل 3x في معقم 1x PBS ؛ الشريحة الزجاجية جاهزة لبذر الخلايا.
4. قم بتعليق الخلايا بعد امتصاص MNP الخلوي ، وقم بزرع 10⁵ خلايا في طبق استزراع 35 مم ، وأضف 2 مل من وسط التمايز. احتضان المزرعة في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
5. بعد 24 ساعة, إضافة 1:100 الفئران الطازجة β-NGF (التركيز النهائي من 50 نانوغرام/مل). تجديد وسط التمايز وإضافة الفئران الطازج β-NGF كل يومين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات لوحة ثقافة الخلايا 6 آبار صقر 353846 لوحة زراعة الخلايا 96 بئر علوم الحياة SPL 30096 محلول الأمفوتريسين B الصناعات البيولوجية 03-028-1 ب ألبومين مصل الأبقار (BSA) الصناعات البيولوجية 03-010-1 ب قارورة زراعة الخلايا والأنسجة بيوفيل TCF002250 75.0 سم ^ 2 250 مل غطاء تهوية، غير معالج طبق زراعة الخلية غرينر بيو ون 627-160 35 مم أنبوب الطرد المركزي بيوفيل CFT021500 50 مل الكولاجين من النوع الأول شركة كورنينج 354236 ذيل الجرذ ، نطاق التركيز 3-4 مجم / مل إبرة يمكن التخلص منها كي دي إل 23 جرام حقنة يمكن التخلص منها ميديسبو 1160227640 10 مل مصل الحصان المتبرع الصناعات البيولوجية 04-124-1 أ الإيثانول 70٪ رومال المحدودة 19-009102-80 الإيثانول المطلق (المجفف) المواد الكيميائية Biolab 52505 مصل الأبقار الجنينية (FBS) الصناعات البيولوجية 04-127-1 أ الفئران الطازجة β-NGF بيبروتك 450-34 GMW C- المغناطيس الكهربائي الإطار . أنظمة باكلي المحدودة 3470 ، 45 مم ل-جلوتامين الصناعات البيولوجية 03-020-1 ب برنامج تلفزيوني 10x هايلابس BP507 / 1LD خط خلية PC12 ATCC [رل-1721] محلول البنسلين والستربتومايسين نيستاتين الصناعات البيولوجية 03-032-1 ب RPMI 1640 مع L-glutamine الصناعات البيولوجية 01-100-1 أ